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PCR技术

微流控 PCR

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介微流控 PCR(micro flow-through PCR)是 Martin 等人在 1998 年发明的一种新的流动扩增 DNA 的技术孔 作为第三代 P

简介

微流控 PCR(micro flow-through PCR)是 Martin 等人在 1998 年发明的一种新的流动扩增 DNA 的技术孔 作为第三代 PCR 技术,它的反应体系更小、所需时间更短,而扩增效率并不亚于常规 PCR 和微室 PCR(micro chamber PCR)0 在昂贵稀少样本的检测中有广泛的应用。

原理

微流控 PCR 芯片的实验原理是在其芯片中有 A、B、C 三个恒温区,分别用于 PCR 的变性、复性和延伸,三个恒温区之间有绝缘材料防止热扩散。在芯片上蚀刻微通道,PCR 反应液和不混溶的载液在微通道中连续流动,顺次循环通过这三个恒温区完成扩增反应。微通道的蚀刻模式决定了反应液通过各温度区的时间比以及循环数,微通道的长度以及样品的流速决定了反应时间的长短。两个参数(U 和 D)用于描述样品和试剂的温度均一性和偏差。反应结束在出口收 集反应液,电泳检测扩增效率,或在反应液中加入荧光染料,以光度计直接检测。

用途

微流控 PCR 除了可以处理 DNA 样品之外,还可以对 RNA 样品进行反转录 PCR。因此,微流控 PCR 可广泛应用于病毒感染的 快速分子检测、毒物筛查等。如不对称螺旋管芯片的发明者 Hartung 等人就釆用微流控 RT- PCR 检测感染 HPV(人乳头瘤病毒)的 SiHa 细胞,结果发现灵敏度很高,阳性细胞的浓度低至每微升 5 个细胞时都可以检测到病毒的 mRNA。

材料与仪器

器材:

加样注射泵;扩增柱(不对称螺旋管芯片);Teflon FEP 连接管。


试剂:


模板 DNA; dNTPs(各 10 mmol/L); PCR 缓冲液(10X);引物;BSA; MgCl2 ; T 纣聚合 酶;SYBR green(1 : 10000 稀释)(结果以光度计检测时加入);水;载液。

步骤

以不对称螺旋管芯片为例进行介绍,微流控 PCR 芯片的基本过程可分为如下几步:
①配制 PCR 反应液并混匀,25ul 反应体系的组成如下
模板 DNA 15ng
dNTP(各 10 mmol/L) 1 mmol/L
PCR 缓冲液(10X) 2.5ul
每个引物 1ul
BSA 0.1ug
MgClz lmmol/L
聚合酶 0.5pd
SYBR green(1: 10000 稀释)(结果以光度计检测时加入)
水补至 25ul
②设定不对称螺旋管芯片各恒温区的温度;
③待温度达到设定值,用注射泵按一定的流速将反应液注入芯片,使其匀速通过微通道;
④在出口收集反应液,电泳检测或以光度计检测


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