间接法原位 PCR

原位 PCR（in situ PCR）就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，在分子和细胞水平上检测特定的基因组序列、转基因及外源基因，对研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值，在分子生物学、细胞学、分子病理学及临床诊断领域里具有巨大的应用前景。

间接法原位 PCR的基本原理是在固定组织、细胞标本并用蛋白酶消化处理后，先通过PCR扩增靶细胞内特定的核苷酸序列，再结合原位杂交进行核苷酸序列的检测及细胞内定位。

器材：

①原位PCR仪

②恒温水浴箱

③显微镜

④离心机

⑤硅化的载玻片、盖玻片

⑥微量移液器（20 μl）、枪头（灭菌）

试剂：

①材料：培养的细胞、特异核苷酸探针

②10％ 福尔马林缓冲液、PBS、蛋白酶K及其缓冲液、TE

③上游引物及下游引物（20 μmol／L）、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、10 x PCR反应缓冲液、Klenow 酶、Dig-dUTP、随机引物

④0.2 mol／L EDTA（pH 8.0）、4 mol／L LiC1

⑤杂交液、杂交缓冲液I、杂交缓冲液II、杂交缓冲液II

⑥显色液

⑦羊抗地高辛抗体-碱性磷酸酶结合物（1：500）、羊血清

⑧Triton X-100、20 x SSC、4 x SSC、2 x SSC和0.1 x SSC

⑨无水乙醇、70％ 乙醇

间接法原位 PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）10％ 福尔马林缓冲液。

（2）蛋白酶K 用灭菌的50 mmol／L Tris（pH 8.0），1.5 mmol／L乙酸钙溶解蛋白酶K粉末，配制成浓度为20 mg／ml的溶液，-20 ℃贮存，工作浓度为0.25 mg／ml。

（3）dNTP混合液将dATP、dGTP、dCTP和dTTP钠盐各100 mg 合并，加去离子水2 ml溶解，用0.1 mol／L NaOH调节pH值至7.0～7.5，使其浓度为5 mmol／L，分装后-20 ℃保存。

现也有商品化的混合液（各2 mmol／L）供应。

（4）Taq DNA聚合酶 5 U／μl，使用时其在50 μl反应体积终浓度为3 U。

（5）PCR反应缓冲液（10x）500 mmol／L KC1,100 mmol／L Tris-HCl（pH 8.4）， 15 mmol/L MgCl2，0.5% Tween-20,1 mg/L BSA。

（6）上游引物及下游引物 根据所要检测的核苷酸序列，用引物设计软件设计最适的上游引物及下游引物，由DNA合成仪合成，浓度为20 μmol／L。

（7）Klenow酶 5 U／μl。

（8）0.2 mol/L EDTA pH 8.0。

（9）4 mol/L LiCI。

（10）TE 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

（11）杂交液 50％ 去离子甲酰胺、4 X SSC、10％ 硫酸葡聚糖、0.5 ng／μl地高辛标记的探针。

（12）杂交缓冲液I 100 mmol／L Tris-HC1,150 mmol／L NaCl，pH 7.5。

（13）杂交缓冲液II 100 mmol／L Tris-HCI，100mmol／L NaCl，50 mmol／L MgCl2，pH 9.5。

（14）杂交缓冲液III 10 mmol／L Tris-HCI，1 mmol／L EDTA，pH 8.0。

（15）显色液 硝基苯四唑盐（NBT）45 μl，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐35 μl，左旋咪唑2.4 mg，加缓冲液II至10 ml。

（16）4 x SSC、2 x SSC和0.1 x SSC 用20 x SSC稀释（20 x SSC：3 mol／L NaCl， 0.3 ml／L柠檬酸钠，用1 mol／L HCl调节pH至7.0）。

（二）培养细胞的处理

（1）用PBS直接洗培养皿中的细胞1次，加10％ 福尔马林缓冲液静置过夜，2000 r／min离心5 min，用5 mlPBS重悬细胞，吸50 μl点在载玻片上。

（2）取3个载有细胞悬液的载玻片，用硅油硅化，该过程对细胞的吸附必需。

（3）蛋白酶消化：加蛋白酶K及其缓冲液，蛋白酶K的工作浓度为0.25 mg／ml，消化时间以室温下10～15 min为宜。

（4）用蒸馏水洗去消化酶，再加热载玻片至95～100 ℃ 2 min，以使消化酶灭活。

（三）PCR反应

（1）待载玻片冷却后，加入25 μl PCR反应液：2.5 μl 10 x PCR缓冲液，2.5 μl dNTP（每种核苷酸终浓度为200 μmol／L），上游引物及下游引物各1μl。

加盖玻片后置PCR仪上加热至65～80 ℃时，立即揭开盖玻片一角，向内加入预先准备好的1.5 U Taq DNA聚合酶，即所谓的“热启动（hot start）”法。

（2）立即在盖玻片四周及上面滴加已预热的石蜡油固定盖玻片。

（3）使用原位PCR仪进行PCR反应：94 ℃变性3 min后，94 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，30个循环。

（4）PCR完成后，用二甲苯洗5 min去除石蜡油，再用无水乙醇清洗5 min，空气干燥。

（四）探针的标记

反应液中加入约1 μg变性的特异核苷酸探针，2 μl随机引物，2 μl dNTP及 Dig-UTP，混匀后加5 U Klenow酶，无菌双蒸水补足50μl。

37 ℃水浴1～2 h，加0.2 mol／L EDTA（pH8.0）2 μl终止反应，加2.5 μl 4 mol／L LiCl和75 μl -20 ℃预冷的无水乙醇，-20 ℃放置2 h，12000 g离心20 min，沉淀以预冷的70％ 乙醇洗涤，离心干燥后溶于TE，-20 ℃贮存。

（五）原位杂交

（1）在载玻片上加10～30 μl杂交液（预杂交液加上探针），加盖玻片，石蜡油封边。

（2）94 ℃变性8 min，42 ℃杂交过夜。

（3）完成杂交后，用二甲苯洗去石蜡油，再用无水乙醇脱苯。

（4）将载玻片在2 x SSC中移去盖玻片，然后用4 x SSC，42 ℃洗3次，每次5 min；0.1 x SSC，42 ℃洗3次，每次5 min。

（六）显色

将载玻片用缓冲液I洗1 min，含2％ 羊血清和3％ Triton X-100的缓冲液I于37 ℃孵育30 min，滴加羊抗地高辛抗体-碱性磷酸酶结合物，室温3～5 h。

缓冲液I冲洗10 min，缓冲液II洗10 min，避光处将载玻片封于装有显色液的暗盒内，孵育2～4 h，用缓冲液II浸洗终止反应。

（七）实验结果及分析

（1）细胞的固定 并非所有的固定剂都能成功地用于原位PCR。经乙醇或丙酮固定的细胞，其原位PCR产物常游离于反应物中，反映了这些固定剂未能很好地将蛋白及核酸变性、交联。

相反，10％ 的中性福尔马林则能很好地使蛋白质凝聚，核酸交联，从而形成有效的限制PCR产物扩散的网络性屏障。固定的时间以不超过15 h为宜。

（2）蛋白酶消化 适当的蛋白酶消化，有利于建立PCR试剂接触靶DNA的通道以及充分暴露靶DNA。

但由于蛋白酶消化同时会破坏业已形成的蛋白质-核酸网络，过量的消化使PCR产物容易扩散，因此应掌握消化的时间。

（3）在原位PCR过程中，靶序列的充分暴露及试剂最大限度地进入细胞发挥作用应该是把握的关键。

原位PCR反应体系中引物、Taq DNA聚合酶和Mg2＋浓度应比常规液相PCR要高些，特别是Mg2＋浓度。

（4）引物的设计及选择 除了一般PCR反应引物设计的原则以外，在进行原位PCR时，所选用的引物，其扩增产物的长度不可太短，否则容易扩散；也不可太长，否则会影响扩增效率。

（5）减少引物错配 采用热启动方法，在进行PCR反应时，常在相对高的温度再加入Taq酶或引物，即“热启动”法。

这种方法可以大大降低非特异性DNA的合成，减少引物错配的可能性，敏感性高，特异性强。

（6）循环周期 原位PCR的扩增效率不及液相PCR，因而循环周期不宜太少，否则物少，信号太小；但周期太多，产物会扩散，并且有大量非特异性DNA合成。

因此，通常采用的周期为20～30个。

（7）原位杂交地高辛标记探针标记数应不低于50％ ，杂交液中探针浓度不低于5 pmol／ml，太低者则杂交信号弱。杂交温度需根据探针中核苷酸（G＋C）含量计算。

（8）阴性对照 原位PCR反应容易产生假阳性或假阴性，为此设置适当的对照是很有必要的。用DNA或RNA酶消化对照，省略引物、聚合酶和探针等阴性对照是必需的。

采用阴性标本或阳性标本进行每一过程则能保证所有试剂和过程都很适当。