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PCR技术

反向 PCR 实验

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移,可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知 DNA 片段的序列,并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆,建

简介

反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移,可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知 DNA 片段的序列,并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆,建立全长的 DNA 探针。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列。


方法原理


反向 PCR 的基本原理是选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补,但两引物 3 端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA,然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子,通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状 DNA 片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。


方法应用


反向 PCR 可用于:

(1)基因游走研究;

(2)转位因子研究;

(3)已知序列 DNA 旁侧病毒整合位点分析等研究。

材料与仪器

试剂:
T4 DNA 连接酶(T4 DNALigase)、引物、 EcoR I 、ddH2O、酚、氯仿、无水乙醇、乙酸钠
仪器:
PCR 仪、电泳仪、离心管、离心机、超净台、水浴锅

步骤

反向 PCR 的基本过程可分为如下几步:


一、限制性内切酶消化

  1. 选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组 DNA 定量。

  2. 根据 T-DNA 的左边界序列选择合适的酶切位点 EcoRI,BamHI 和 HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物 Z1,Z2,Z3 和 Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组 DNA,37℃ 过夜,电泳检测酶切效果。


二、回收 DNA


  1. 将酶切产物转到 1.5 ml 离心管中,用 ddH2O 洗涤干净,并稀释到 250 ul;

  2. 加入等体积的酚和氯仿(V:V = 1:1),涡旋混匀,室温静置 1 min;
  3. 最大速度(13 000 rpm)离心 1 min;

  4. 将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置 1 min;

  5. 最大速度(13 000 rpm)离心 2 min;

  6. 将上清移到另一管中,加入 2.5 倍体积的- 20℃ 预冷的无水乙醇,0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠(pH = 5.2),轻轻振荡混匀,室温静置 5 min;

  7. 4℃ 最大速度(13000 rpm)离心 10~15 min;

  8. 弃上清,尽量除去管壁上的液体;

  9. 加入 1 ml - 20℃ 预冷的 70% 乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13 000 rpm)离心 5 min;

  10. 除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40 ul ddH2O 溶解。- 20℃ 保存。


三、连接


  1. 连接体系 2 - 14℃,过夜连接完成后,65℃ 水浴 10 min 灭活。抽提回收,溶解于 40ul ddH2O 中。

  2. 回收的链接片段做 PCR。

注意事项

注意事项


连接体系比较大,而 DNA 含量比较低,不需加入 PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。


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