反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量的 RNA 样品分析成为可能。

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

器材：

①紫外分光光度计、紫外检测仪

②恒温水浴箱

③电泳仪、电泳槽

④PCR 仪

⑤0.5 ml 及1.5 ml Eppendorf 管（Ep 管）若干、20 μl 和 200 μl 吸头

⑥可调加样器（20 μl 和 200 μl 各 1 支）

试剂：

①材料：新鲜组织、培养细胞等 RNA 来源

②RNA 提取试剂

③DNA 分子质量标准（Marker，1 kb 梯度）

④琼脂糖、5 x TBE、TE

⑤oligo（dT）12～18、第一链 cDNA 合成试剂盒、10 x PCR 缓冲液

⑥dNTP 混合物（含等量 dATP、dCTP、dGTP、dTTP）

⑦无水乙醇

⑧Taq DNA 聚合酶

⑨DEPC 处理水、双蒸水（ddH2O）、灭菌水

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的基本过程可分为如下几步：

1．总 RNA 的提取

（1）取已从活体上取下的组织约 1.5 g 置冰上，剪成 1 mm3 小块，加 5 ml 预冷的变性液，迅速匀浆 15～30 s。

（2）转移入 15 ml 离心管中，加 1 ml 2 mol／L 乙酸钠（pH4.0），翻转混合。

（3）加 1 ml 氯仿［氯仿-异戊醇（49:1）］，翻转混合，猛烈振摇 10 s，冰浴 15 min。

（4）4℃ 离心（10000 g × 20 min）。

（5）将上层水相移入新 15 ml 离心管，加 2 倍体积冷无水乙醇，置 -20℃ 保持 1 h 以上。

（6）4℃ 离心（10000 g × 20 min）。

（7）弃上清液，加 2 ml 变性液重悬沉淀。

（8）转入新管，加 2 倍体积冷乙醇置 -20℃ 沉淀 1 h 以上。

（9）4℃ 离心（10000 g × 20 min）。

（10）沉淀用 70％ 乙醇洗 1 次。

（11）空气干燥，沉淀溶解在 100 μl DEPC 处理水中，-70℃ 贮存。

2．cDNA 第一链的合成

（1）反应体系：在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA，1～5 μg；10 μmol／L oligo（dT）12～18，1 μl；补充适量的DEPC处理水，使总体积达 12 μl。轻轻混匀，稍离心。

（2）65℃ 加热 5 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min。

（3）然后加入下列试剂的混合物 5x 反转录缓冲液，4 μl，12.5 mmol／L dNTP，1 μl。补充适量的 DEPC 处理水，使总体积达 19 μl。轻轻混匀，稍离心。

（4）65℃ 孵育 2～5 min。

（5）加入 MMLV 反转录酶 1 μl（200 U），混匀，稍离心。

（6）在 37℃ 水浴中孵育 60 min。

（7）于 95℃ 加热 5 min 以终止反应。

（8）-20℃ 保存备用。

3．PCR

（1）取 0.5 ml PCR 管，依次加入第一链 cDNA，2 μl；上游引物（10 pmol／L），2 μl；下游引物（10 pmol／L），2 μl。

dNTP（2 mmol／L），4 μl； 10x PCR 缓冲液，5 μl；Taq 酶（2U／μl），1 pl；加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 μl。

（2）轻轻混匀，稍离心。

（3）设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28～32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入 1 对内参（如 β-肌动蛋白）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照。

（4）电泳鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

4．实验结果及分析

采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行灰度扫描，用 β-肌动蛋白条带的灰度对目的条带的灰度进行校正（目的条带灰度／β-肌动蛋白条带灰度），得到目的条带的半定量结果。

（1）在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂。

（2）为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

（3）内参的设定，主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G-3-PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-肌动蛋白等。

其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。

（4）PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

（5）防止 DNA 的污染 ①采用 DNA 酶处理 RNA 样品；②在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。

（6）目前试剂公司有多种 RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链试剂盒、PCR 试剂盒以及 RT-PCR 试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

如果使用试剂盒，具体操作步骤请参照试剂盒说明书。