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PCR技术

Real-time PCR(基本方法二)

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
材料与仪器关于 Trizol Reagent 需要的试剂1. Chloroform:氯仿 (分析纯)2. Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)

材料与仪器

关于 Trizol Reagent 需要的试剂


1. Chloroform:氯仿 (分析纯)

2. Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)

3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。

4. RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500 ml(50 ul),在37 ℃过夜,并高压灭菌即得(150 ℃ 3小时)

5. 一次性塑料手套

6. 注意:DEPC 致癌之嫌

7. 抽提出的细胞总 RNA 干燥后加水 50 ul,取10 ul 加无 Rnase 水 990 ul,稀释100倍成1 ml。于 0.5 cm 厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:A260/280 ratio <1.6。

8. 分离组织 10 mg(纯组织)加 800 ul Trizol 试剂。


步骤

DEPC 处理方法如下

1. DEPC处理

(1)DEPC水:100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC,充分混匀,高压灭菌。

(2) Tip头(枪头). EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头;EP管和PCR反应管等):用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加入1ml DEPC)37 ℃浸泡过夜,高压灭菌。

2. 提取RNA,用 DEPC 水溶解

3. RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。

4. 操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套。 最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下,枪头盒插好枪头后,加入1-2 ml的0.1%DEPC水,再灭菌就行了;现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买,直接用不用处理的。


如何消除污染?

机器运行完后,取出PCR产物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。

(1) 试剂:mixer尽量分装,不要原瓶多次取用。

(2) 加样:原则是DNA最后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。 另外,普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。 目前,国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶,来源于大肠杆菌重组克隆表达。


RNA 定量


RNA也最好至少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 RNA的贮藏,最主要的是温度,-20不够,最好-80,液氮最保险 mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。


RT-PCR有两种做法


条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行 一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量。


mRNA的分离与纯化


步骤(4)中将RNA溶液置65 ℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。


下面,我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法:


保温试验方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70 ℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件), 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70 ℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。


PCR污染与对策


1. PCR扩增产物污染


这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,所以,扩增区的仪器什么如枪头等要注意。 还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。


1)标本处理区,包括扩增摸板的制备;


2)PCR扩增区,包括反应液的配制和PCR扩增;


3)产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。


各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染; 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度。


2. 反应液污染 可采用下列方法之一处理:


1)DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5 U DNase I,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列;


2)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法 由于UV照射的去污染作用对500 bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300 bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。


a、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干,高压灭菌,再烘干。


b、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢?还要用双蒸水洗吗?


c、玻璃器皿干烤:180度,8小时或更长时间;小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外,铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。


注意事项

实验中必须坚持的一些好习惯
1. 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均。
2. 移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性。
3. 所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 ℃的高温下干烤6 h或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10 min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37 ℃处理12 h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22 μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩. 帽子. 手套,实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类. 动物. 植物. 微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80 ℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。
1. 将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10×106个细胞加1 ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞; 2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30 ℃下放置5分钟;然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下(15 ℃~30 ℃)放置2~3分钟后,12 000 g(2 ℃~8 ℃)离心15分钟; 3. 取上层水相(离心后,混合物将分离为底层为浅红的. 中层为酚-氯仿相. 上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%)于一新的离心管,按每1 mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温(15 ℃~30 ℃)放置10分钟,12 000 g(2 ℃~8 ℃)离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质,保留中层和下层酚-氯仿相,有机相能保存在4°C一夜】
4. 弃去上清液(RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁),按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤,涡旋混匀,4 ℃下7 500 g离心5分钟【RNA能够在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年,4°C保存至少1周】
5. 小心弃去上清液,让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会使RNA失去溶解性,导致A260/280 ratio <1.6。
6. 加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀,用枪头反复吸取混匀,55-60 ℃水浴10-15 min。进行下游实验或-70 ℃保存备用。
7. RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
预计的总RNA产量:
[注意]
1. 整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值 2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周,-20 ℃保存一年。


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