定 量 PCR 技 术 简 介

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下： 一、  定量PCR的基本原理： 在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理： 在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY�n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素： 以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有： a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。 b.  模板的含量、DNA聚合酶、反应液成分变化。 c.  不同临床标本间DNA聚合酶抑制物的存在情况。 d.  循环扩增仪上不同位置的差异。 二、  定量PCR方法的分类： 目前对标本的靶DNA或基因的相对或绝对含量是不同样品的PCR产量检测而推算出来，根据标本中是否加入内标物，将分成以下两种： （一）  外标法定量PCR： 一个已知含量的标准品（通常用质粒）经一系列的稀释后与待检标本一起进行扩增，制作PCR扩增产物和靶核酸含量的标准曲线，根据待检标本的扩增产物量即可推算出靶核酸的绝对含量；上述已提及不同标本间的扩增效率（Ev）的差异，对样本间PCR产量作比较会产生很不准确的结果；以外还应考虑“平台效应”对结果的影响，因为“平台期”PCR产物量并不受初时模板量的影响；导致结果的准确性和重复性差，因此采用外标法应该注意： a、  注意标准化操作，优化最佳实验条件，减少标本间Ev的差异导致对结果的影响。 b、  标准品的稀释因存在随机分布而导致结果的不准确。 c、  注意“平台效应”对实验结果的影响。特别是后面提及的终点法检测PCR产物的方法中。 d、  由PCR方法很灵敏，特别RT-PCR方法，没有内标存在的情况下，标本的污染而对实验结果产生很大的影响。 e、  标本处理对结果的影响。 （二）  内标法定量PCR： 由于上述提及的外标法存在不同标本间的Ev差异和标本的提取（特别是RT-PCR）的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异。为了清除此种影响，国内外都推重采用内标法。内标法是用PCR技术进行准确定量的基础和今后的发展方向，根据采用内标品的不同，又分为非竞争内标定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和竞争定量PCR（competitive quantitative PCR） 1、   非竞争内标定量PCR 从细胞类标本中提取靶基因（核酸）时，同时会提取大量与靶基因无关的DNA或RNA；可以把这些靶基因无关DNA或RNA作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增来自同一标本的一段靶基因序列和另一段无关的内标序列，不享受同一引物和引物结合位点，内标序列扩增可校正诸如DNA含量、标本内PCR聚合酶抑制物，不同反应管间扩增效率的差异，通过比较两种序列和内标序列的扩增产物即可对靶基因相对定量该方法目前主要用于检测靶基因在体内的含量前后变化，用于疾病的治疗检测。这种方法应注意靶序列和内标序列的扩增效率差异和初始模板DNA含量比例关系和循环次数所导致的“平台效应”对结果的影响。该法的主要优点是简便（不需构建内标品操作），可以消除反应管之间差异和一定程度上消除标本间变异。 2、竞争定量PCR（competitive quantitative PCR） 竞争定量PCR是先构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因和内标物和引物（primer）竞争性结合，进行同步扩增，由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物相对逐渐减少，但两种扩增产物的比值和两种初始状态时模板分子数的比值是一致的。根据标准品的准确含量制作标准曲线，从而进行准确核酸定量。由于内标品构建中特别要求是Ev与靶基因扩增效率一致，如果靶基因序列和内标相同，那么扩增过程中两者的实际扩增效率就接近一致，就可以对靶基因进行绝对定量，即确定样品中靶基因准确分子数，否则只能相对定量，即确定样本间靶基因分子数的差异，总体上说，加入内标物，消除PCR扩增过程中于反应管和反应管间以及标本之间存在差异。因此，内标法是目前PCR定量方法中最准确的方法，但构建内标物是建立本方法的关键。 构建内标物的基本原则是内标物具有靶基因的相同扩增条件和相同扩增效率。和可区别于靶基因探针结合位点与不干扰靶基因的扩增。因此，理想的内标物应具备与靶基因序列待分析序列相同的引物结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。目前，内标法构建的方法有：靶基因扩增产物的突变；限制性片段的插入或缺失；含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列等，其中通过PCR方法构建的探针结合位点核苷酸直接突变构建的内标物是目前应用最多、最方便的方法。 三、  PCR产物的检测与定量 定量PCR检测靶基因核苷酸的含量最终是通过对其PCR产物的特异性检测和定量而推测算出来的，根据对PCR产物检测方式不同分为终点法（Terminal detection）和实时检测法 (real time detection). (一)  终点检测法(Terminal detection） 终点检测法就是PCR扩增反应结束后，对其产物进行分析和定量检测的一种方法，终点法检测要特别注意“平台效应”对实验结果的影响。为了实现对PCR终产物的定量检测，必须对PCR产物进行预先标志。目前标志物有：放射性同位素和非放射性标志物。放射性同位素因放射性因素而目前很少用，后者包括螺旋结构染料（如溴化乙锭等）、地高辛、生物素以及荧光素（包括普通荧光素如Fam、TRAMA和镧系螯合物等），地高辛、生物素以及荧光素可以通过标志dNTP或引物的5’端从而掺入PCR扩增产物中，除荧光素标志产物可直接发光外，其余可与HRP或AKP标志的抗地高辛抗体或亲和素反应，加入底物后产生颜色、发光或荧光信号，从而进行检测。这些标志物进行标志的是检测时的捕获剂或是作为定量检测的指示剂；根据对PCR终产物的检测特异性不同又可分为： 1. 琼脂电泳扫描检测法： PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色然后进行扫描；预先用放射性标记的可进行放射自显影或特异性扩增琼脂片的放射性计数；预先荧光素标记核苷酸进行定量，DNA测序仪可克服琼脂电泳的序列非特异性检测问题，可用于内标和外标法检测，但是由于全自动DNA测序仪耗时及费用昂贵，目前仅限于实验室研究用。 2. 固相捕获法（solid phase capture） 固相捕获法多数是利用亲和素或抗地高辛抗体包被聚丙烯酰胺微孔板或磁性小珠，利用亲和素和生物素或地高辛和抗地高辛抗体系统对预先标记生物素或地高辛的产物进行捕获然后与特异性标记的探针进行杂交或非特异性检测。或是使生物素或地高辛化探针固相化，并与预先标记的PCR产物进行杂交，然后进行捕获信号显示，根据标记在探针或PCR产物终中的显示信号标志物的分分成不同的检测方法，如ELISA检测又称PCR-ELISA，电化学检测，电化学发光检测法，荧光检测法以及时间分辨荧光检测法，是目前终点法检测应用最方便的方法。目前有三种设计模式： (1) 特异性捕获检测法（非探针杂交捕获） 本法是非特异性检测PCR产物的一种方法，用生物素标记引物和地高辛标记duTP或用生物素和地高辛分别标记其引物。经PCR扩增后，PCR产物中同时掺入了生物素和地高辛。用生物素包被孔捕获PCR产物，用酶（AKP）标抗地高辛和产物反应，加底物显色进行定量，此法是非序列特异性检测，显色来自所有的扩增产物。本法仅应用于非常特别的PCR扩增产物检测。 (2) 特异性探针捕获检测法 由于PCR产物中存在非特异性扩增成分存在，用特异性探针能够特异性检测其PCR产物，提高方法特异性。本法就是固相捕获、探针杂交相结合的一种特异性PCR产物检测方法，基本原理是用固相捕获分子和进行检测标记物分别位于不同核苷酸链上，通过核苷酸链相互杂交，靶两标记物结合在一起，其余方法同非特异性捕获法。根据其固相捕获的方式不同，又分为固相捕获探针法、固相扩增产物法，前者就是通过生物素和亲和素系统把特异性探针结合在固相上（即固相化探针），与预先标记的PCR产物进行杂交，然后一系列反应后进行定量检测。而后者就是生物素标记的PCR产物通过与预先包被在微孔板上亲和素反应而进行捕获，与地高辛标记探针杂交，标记抗地高辛抗体反应，加底物显色后呈色而进行定量检测。 3. HPLC检测法 本法为非特异性PCR产物检测法，PCR产物直接上2.5μm离子交换柱分离后，用紫外检测器进行检测。本法灵敏度可达fg水平，还可以用于长度不同的内标物检测，而且初始模板数和PCR产物峰面积之间具有良好的线性关系。 （二）  实时检测法 实时检测法就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。根据PCR 变化曲线计算出未标靶基因分子数。由于实时检测，克服终点法检测过程中“平台效应”对结果的影响；实时检测仍然存在反应管之间和标本之间的扩增效率（Ev）的微小差异，导致结果的很大差异，故最好应用内标法进行较正。为了实现单管内进行实时检测的目的，就必须使探针上标记物（指示物）在杂交或游离状态存在发光强度差异，从而达到实时定量检测的目的。目前该技术主要有： 1、  Taqman荧光定时定量PCR 本法是由PE公司建立的定时定量PCR技术，本系统采用了两端标记了荧光素（5’端荧光发光基团[R]-FAM（6-羧基荧光素）和3’端荧光猝灭基团[Q]-TETRA（6-四甲基罗达明））的寡核苷酸探针，称为Taqman探针，Taqman PCR方法的原理是上述Taqman探针上两个荧光物质间可能发生能量转移现象，即应用Xnm的光（发光基团[R]的激发波长）照射[R]使其激发，发出波长X’nm的荧光，激发猝灭基团[Q]，其发出波长为Ynm的荧光，也就是发光基团[R]所发出的光能一部分被用于激发猝灭基团[Q]使其发光，当PCR反应开始后，Taqman探针与扩增链杂交，当新链延伸到Taq酶探针杂交位置时，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切酶特性沿5’-3’方向切除方向上的障碍物-探针而进一步延长，使Taqman 5’端发光基团[R]游离出来，能量转移现象终止，检测到[R]发出的荧光，其荧光强度与PCR产物量成正比。Taqman技术优点有a、不需开盖检测，PCR扩增过程中实施实时分析，不需要PCR结束后的分析步骤，减少污染。b 在常规PCR扩增过程中，用探针对产物进行检测，可获得较高的检出精度。 2. LightCycler双探针技术 LightCycler双探针技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分于便紧密相邻，从而发生能量传递而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。