以质粒为模板的 PCR 实验流程

聚合酶链式反应热变性温度下成熟质粒可以解螺旋、解聚，暴露的单链核苷酸序列可以作为模板，在特异引物、脱氧核糖核酸酶、DNA 聚合酶等存在的情况下扩增出大量目的序列。

扩增出大量特异的目的 DNA 分子

仪器：PCR 热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外透射仪。

材料：成熟质粒、PCR 管。 

试剂：10 × PCR Buffer（含 Mg2+）、dNTP、引物对、耐热 DNA 聚合酶、TAE、10 × loading-buffer、琼脂糖、EB。

1、在 0.2 ml PCR 管中配制 25 μL 反应体：2.5 mmol/L dNTP 混合物 2 μL、10 × PCR buffer 2.5 μL、正向引物（10 μmol/mL）1 μL、反向引物（10 μmol/mL）1 μL、稀释后的成熟质粒模板（0.01 μg/μL）1 μL、DNA 聚合酶 1 U（0.5 μL）、高压灭菌 ddH2O 补齐至 25 μL。

2、按以下程序在 PCR 仪内进行扩增：① 94 ℃ 预变性 5 min，② 94 ℃ 变性 1 min，③ 55 ℃ 退火 1 min，④ 72 ℃ 延伸 2 min，⑤ 重复步骤 ②→④ 25~35 次，⑥ 72 ℃ 延伸 10 min。

3、用 1 × TAE 溶液配制 0.8~1% 琼脂糖凝胶，25 μL PCR 扩增产物补加 3 μL 10 × Loading buffer 和 2 μL 高压灭菌 ddH2O，恒压 80~120 V 跑琼脂糖凝胶。

4、凝胶成像仪器或紫外透射仪下观察电泳结果。

1、成熟质粒测量好浓度后用高压灭菌 ddH2O 稀释至 0.01 μg/μL，充分混匀；

2、PCR 系统中的酶加入量为 1 个单位，注意购入酶的单位；

3、干粉引物拿到后低速离心后用高压灭菌 ddH2O 稀释 10 μmol/mL，充分混匀；

4、退火温度根据引物序列按公式 Tm ＝ 2 ×（A + T）+ 4 ×（C + G）确定；

5、聚合酶链式反应循环中的延伸时间需根据序列长度和聚合酶效率确定。

1、PCR 产物的准确性

为确保序列准确性，DNA 序列需测序。

2、PCR 后无阳性条带

注意体系中酶的加入量是否过多；退火温度是否合适；循环中的延伸时间设计是否得当；是否漏加模板、引物或聚合酶。