免疫PCR(IM-PCR)

免疫PCR是将抗原抗体反应的特异性与体外扩增DNA的技术相结合，用于检测生物样品中含量极少的蛋白质，如细胞因子，微量抗原等的方法。首先由Sahot等用重组的链霉亲合素和A蛋白的嵌合体，将免疫法和PCR结合在一起而形成。

其基本原理和酶联免疫固相检测法(ELISA)一样，只是标记物质为一段特定的DNA，并且通过PCR扩增进行检测。为此，它要比ELISA敏感10万倍，敏感性可达几百个待检分子。按反应中所用抗体的方式不同可分为：

1. 直接IM―PCR法：将所测抗原吸附在固相载体上，使特异性单抗与之反应，然后用生物素化的多抗通过亲合素与生物素化DNA(标记分子)相连接，再用适宜的引物将后者进行PCR。敏感性可达15pg。

2. 间接IM-PCR（双抗体夹心IM-PCR）：此法用于难以直接吸附于固相载体的抗原检测。将与被检物对应的McAb先吸附在固相载体上，然后使被检抗原与之反应。再用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过亲合素再与生物素化DNA相连接，然后以适当的引物对DNA指示分子进行PCR扩增。

由于此法是以扩增的DNA量来反映待检抗原的量,所以要用不同浓度的标准抗原同时进行PCR，以获得标准抗原(根据生成DNA量计算)的剂量反应曲线，然后从标准曲线上读取待检抗原量。

PCR扩增产物的测定，一般是用2%琼脂糖凝胶进行电泳，然后按DNA合成时所掺入的同位素脱氧核糖核苷酸的放射性，或者按DNA被溴化乙锭(EB)染色的程度来判定。Mantero等(1991)发展了DNA的酶免疫分析法(DEIT)。

此法是用一个吸附亲合素的固相载体,去结合带有生物素的特异性寡核苷酸探针。于是可将所得的变性PCR产物与之杂交。然后用一种能区别单链和双链DNA的单克隆抗体，使其与双链DNA发生反应。然后用酶标羊(或兔)抗鼠IgG抗体及相应底物进行显色。使用这一方法,可检测出单个抗原分子。

材料与试剂包括:

①所测物的单克隆抗体(鼠)；

②所测物的多克隆抗体(兔)；

③生物素化羊抗鼠IgG；

④生物素化羊抗兔IgG；

⑤生物素化dUTP；

⑥Klenow聚合酶；

⑦PCR反应液；

⑧引物(自行设计)；

⑨生物素化DNA标记分子。