反向 PCR

标准 PCR 用来扩增位于两条引物内侧的 DNA 片段，与此相反，反向 PCR 技术（也被称为倒置或者向外 PCR）是用于扩增一段已知 DNA 序列旁侧的 DNA 序列，这些序列中没有可以用于扩增的引物。

在快速高效的 DNA 测序出现之前，这项技术在几个独立课题组内都得到很好的发展前，在多数情况下，测序已成为确定未知 DNA 片段的主要选择手段。然而，反向 PCR 仍旧被广泛应用于快速的等位基因分型，以及确定整合到基因组中的反转录病毒、转基因、转座子的定位。反向 PCR 要用到一种限制性内切核酸酶对大分子 DNA 酶切消化，制备一个包含已知序列及其侧翼区域的 DNA 片段。

个别限制性酶切片段（哺乳动物的基因组 DNA 可能产生成千上万条片段）通过自身分子环化连接，然后这种包含已知序列的环化 DNA 可以被用来作为 PCR 模板。未知序列通过与已知序列特异结合的引物反方向扩增获得。

器材：自动微量移液器、离心机、热循环仪；

试剂：琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶、含 MgCl2 的扩增缓冲液（10x）、ATP （10 mmol/L）、噬菌体 T4 连接酶（1 U/μL）、氯仿、dNTP 混合溶液（20 mmol/L）、乙醇溴化乙锭（EB）或者 SYBRGold 连接酶缓冲液（10x）、溶于水的正向引物（20 μmol/L）和反向引物（20 μmol/L）、酚：氯仿（1∶1，V/V）、限制性内切核酸酶乙酸钠（3 mol/L）、TE 缓冲液（pH8.0）、10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1 mmoI/L EDTA、模板 DNA、耐热 DNA 聚合酶、Tris-HCl（10 mmol/L，pH7.6）。

耗材：带滤芯的吸头、微量离心管或微孔板正排量移液管

1、基于已知 DNA 序列，设计并合成寡聚核苷酸引物 1 和引物 2。

2、用合适的限制性内切核酸酶（见以下注释）消化 2~5 μg DNA 模板（序列 10 bp）。用酚：氯仿提取消化后的 DNA，再用氯仿单独抽提。加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀，离心回收沉淀，用 TE 缓冲液（pH8.0）溶解使浓度为 100 mg/mL。【选做步骤，DNA 消化后置 65 ℃ 加热 15~20 min 使酶失活。用 Southern 印迹杂交实验来选择可以把片段切成适当大小（1~4 kb）的限制性内切核酸酶。为提高模板 DNA 连接时自身环化效率，尽量选择能够产生黏性末端的酶。若只能选择平端酶，则需要在连接缓冲液中加入聚乙二醇。】

3、在 0.5 mL 的无菌微量离心管、PCR 管或灭菌的微孔板中，设定一系列连接反应，其中切割模板 DNA 的浓度范围为 0.1~1 mg/mL。模板 DNA 10~100 ng，连接缓冲液（10x）10 μL，噬菌体 T4 DNA 连接酶（1 U/μL）4 μL，三磷酸腺苷（10 mmol/L）10 μL，水加至 100 μL，反应体系，置 16 ℃ 孵育 12~16 h。

4、连接 DNA 用酚：氯仿提取后，再用氯仿单独抽提。加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀，离心回收沉淀并重溶于 10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6）或水中，浓度为 100 μg/mL。

5、在灭菌的 0.5 mL 薄壁扩增管中加入下列试剂并混匀：扩增缓冲液（10x） 5 μL，4 种 dNTP 溶液（pH8.0），每种浓度在 20 mmol/L 1 μL，寡核苷酸引物 1（20 μmol/L）2.5 μL，寡核苷酸引物 2（20 μmol/L）2.5 μL，耐热 DNA 聚合酶（1~5 U/μL）1.0 μL，水 28~33 μL，连接后的模板 DNA 5~10 μL，总体积至 50 μL。

6、如果热循环仪没有配备热盖，可在反应混合物中加一滴（约 50 μL）轻质矿物油。这样可以避免样品在重复冷热循环中蒸发。另外，在使用热启动 PCR 时可在管中加一粒石蜡。将反应管或微孔板放入热循环仪。

利用下表列出的变性、复性和延伸时间及温度扩增核苷酸：

循环数变性复性延伸 30 个循环，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，末循环 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min

这些时间适用于配制在 0.5 mL 薄壁管中，在诸如 PerkinElmer9600 或 9700Mastercycler（Eppendorf 公司）和 PTC-100（MJResearch 公司）等 PCR 仪上孵育的 50 μL 反应体系。

7、从反应体系以及对照组体系中取出 5~10 μL 样品，通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。使用合适的 DNAmarker。用溴化乙锭或 SYBRGold 进行凝胶染色。成功的扩增反应应该产生一条清晰可见的 DNA 条带，条带可以通过 DNA 测序、限制性酶切图谱分析，或者使用与已知 DNA 序列同源的探针进行 Southern 杂交来进一步鉴定。

1、需要从许多酶中选择合适限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的 DNA 片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶 DNA。

2、基因组 DNA 必须酶切完全。

3、为提高分子间连接的效率，连接反应中 DNA 的浓度要低，因为高浓度的 DNA 可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异性扩增。

4、成环的 cDNA 进行裂解和变性比较重要，因为环状双链 DNA 分子易于形成超螺旋而不利于 PCR 反应，它只可以扩增出较短的 DNA 片段。

5、碱变性法已成功地用于制备 PCR 和测序 DNA，该方法也可以有效地使环化的双链 cDNA 实现变性。

6、除了在模板分子上的位置不同之外，反向 PCR 引物并没有其他特别之处，因此提供的是一般引物。设计的规则：每个引物应该长 20~30 个核苷酸，并且其中 4 种碱基的数量大约相等，G 和 C 的分布要均衡，形成稳定二级结构的倾向低。限制性内切核酸酶酶切位点可以添加到引物 5』端，以便扩增产物的克隆和操作。

7、反向 PCR 需要一个环状的 DNA 作为模板，此方案中，步骤 1~4 描述的是如何将传统方法制备的线性 DNA 转反为环形 DNA，这些线性 DNA 可为纯化的 DNA 片段，也可为总基因组 DNA，或其一定大小的组分；λ 噬菌体 cDNA 文库；一份黏性质粒或噬菌体 P1 基因组文库；或 ~10 bp 以下的 DNA 序列。线性 DNA 的使用量至少在 1 μg 以上以便环化，并在几个浓度下进行 PCR。

8、步骤 3 注意事项：某些商品化的连接缓冲液包含 ATP。若使用此类缓冲液，不需要在连接体系中额外添加 ATP。理论上，利于连接过程中形成单分子环的条件很好找（Collinsand Weissman1984），但在实际中很难做到。为避免分子间的串联，更好地形成分子内环化，DNA 末端的摩尔浓度必须降低。然而，在大小不同的 DNA 分子的分布，以及末端被损坏的分子比例未知的情况下，很难推算出合适的 DNA 浓度，最好的办法就是用浓度范围为 1~10 μg/mL 的 DNA 进行一系列连接反应，然后把这一系列连接反应的产物用于以下步骤。

9、步骤 5 注意事项：线性 DNA 模板有时比环状 DNA 更有益于反向 PCR 的扩增效率。我们可以在两条引物 5』端之间的已知序列区域寻找一个限制性酶切位点，把环化的 DNA 分子线性化。最好这个酶不能对未知序列讲行切割。或者在制备扩增反应体系之前，将模板加热至 100 ℃、15 min，也可以使环状分子线性化，不过效率比较低（Triglia et al.1988；Ochmar et al. 1993）。设置两个对照反应。其中一个反应包含除 DNA 模板以外的上述所有试剂。另一个反应中，用一个携带已知片段大小的质粒取代 DNA 模板，此质粒包含用于设计寡核苷酸引物的 DNA 片段。第一个对照确保任何可见产物都与外源 DNA 无关。第二个反应测试 PCR 各试剂的保真性。

10、步骤 6 注意事项：时间和温度可以根据设备类型及反应体积做适当调整。许多热循环仪的结束程序是扩增样品保持在 4 ℃ 直至被取出。样品可以在此温度下放置过夜，但随后需放在 -20 ℃ 保存。在一个特定的 PCR 反应中，引物对的具体复性温度得靠经验估计。若靶 DNA 较长（大于 4 kb），应当尝试延长延伸时间（每个循环延长到 10 min）。另外，使用突变的、缺乏外切核酸酶活性的耐热 DNA 聚合酶可以获得较长的扩增片段。

1、没有扩增条带

酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

2、模板含有杂质

特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

3、变性温度是否准确

PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Tag 酶以前，将反应体系 95 ℃ 加热 5~10 分钟。

4、引物变质失效

人工合成的引物是否正确。