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DNA实验

用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记

2024-05-20 DNA实验 加入收藏
原理此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后,在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Kle


原理

此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后,在大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下,富集的单链 cDNA 通过随机寡核苷酸引物延伸的二次合成反应,标记成高比活性的探针。由 于第一轮反应中 dNTP 的浓度为非限制性的,所生成 cDNA 的量及大小均高于标准方案,因此扣除杂交步骤以高效进行。由此产生的 cDNA 群体不易受辐射分解的破坏,从而可长期贮存,必要时尚可标记成较高比活性的探针。

材料与仪器

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 反转彔酶 随机脱氧核苷酸引物 模板 mRNA
二硫基苏糖醇 乙醇 EDTA NaOH 胎盘 RNA 酶抑制剂 随机引物缓冲液 醋酸钠 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 微量离心管 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

二硫基苏糖醇(DTT) (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

NaOH ( 3 mol/L)

酚:氯仿(1:1,V/V)

胎盘 RNA 酶抑制剂

5X 随机引物缓冲液(250 mmol/L Tris ( pH 8.0),25 mmol/L MgCl2,100 mmol/L NaCl,10 mmol/L DTT,1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6),使用 1 mol/L DTT 贮存液的新稀释水溶液,贮存于 -20℃。用后弃去稀释的 DTT。)

SDS ( 20% m/V)

醋酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

Tris-Cl (1 mol/L,pH 7.4)

2. 酶与缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

反转彔酶

10X 反转录酶缓冲液

3. 核酸与寡核苷酸

含 4 种 dNTP 各 5 mmol/L 的(完全)dNTP 溶液

含 dCTP、dGTP 和 dTTP 各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液

oligo (dT)12-18

长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物

模板 mRNA

4. 放射性复合物

[α-32P] dATP ( 10 mCi/ml,比活性为 >3000 Ci/mmol)

[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)

5. 专用设备

Sephadex G-50 离心柱,平衡于 TE(pH 7.6)

硅化的微量离心管(1.5 ml)

预热至 45℃、60℃ 和 68℃ 的水浴

二、方法

1. 4℃ 下在一个灭菌的微量离心管中混合下列成分以合成 cDNA 第一链:

模板 RNA (1 mg/ml)                 10 μl

oligo(dT)12-18 (1 mg/ml)         10 μl

5 mmol/L dNTP(完全)溶液      10 μl 

50 mmol/L DTT                           1 μl 

10X 反转录缓冲液                        5 μl

10 mCi/ml [α-32P] dCTP              5 μl

( 比活性 800 或 3000 Ci/mmol)

胎盘 RNA 酶抑制剂                     25 单位

无 RNA 酶的水                           加至 46 μl

反转录酶(~800 单位)               4 μl

2. 检测放射性标记的 dNTP 掺入 TCA 可沉淀物或结合于 DE-81 滤膜的比率。用下列公式计算 cDNA 第一链的产率。



3. 加入下列试剂以终止反应:

0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)     2 μl

20% (m/V) SDS                 2 μl

充分混匀微量管中的各成分。

4. 在反应管中加入 5 μl 3 mol/L NaOH,于 68℃ 温育反应 30 min 以水解 RNA。

5. 将反应物温度冷至室温。加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4),充分混匀以中和溶液,然后加 5 μl 2.5 mol/L HCl。点一小滴溶液(<1 μl)在 pH 试纸上以检测溶液的 pH。

6. 用酚:氯仿抽提纯化 cDNA。

7. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的探针与未掺入的 dNTP。

8. 进行两轮扣除杂交。

9. 用异丁醇序贯抽提浓缩 cDNA,通过 Sephadex G-50 层析除盐。

10. 用标准乙醇沉淀回收 cDNA。将 cDNA 溶于水,终浓度为 15 ng/μl。

11. 为了对扣除 cDNA 进行高比活性的放射标记,在一个 0.5 ml 微量离心管中混合下列成分:

扣除 cDNA                                     5 μl

随机脱氧核苷酸引物(125 μg/ml)   5 μl

12. 加热混合物至 60℃ 5 min,然后冷却到 4℃。

13. 向引物:cDNA 模板混合物中加入:

5X 随机引物缓冲液               10 μl

含 dCTP、dGTP 和 dTTP

各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液    5 μl

10 mCi/ml [α-32P] dATP

( 比活性为 >3000 Ci/mmol) 25 μl

Klenow 片段(12.5 单位)    2.5 μl

水                                       加至 50 μl

室温下反应 4~6 h。

14. 加入下列试剂以终止反应:

0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)   1 μl

20% (m/V) SDS                2.5 μl

15. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 cDNA 与未掺入的 dNTP。



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