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DNA实验

缺口平移实验基本方案

2024-05-25 DNA实验 加入收藏
原理缺口平移是一种将标记核苷酸掺入到DNA中的方法,这些DNA可以是孤立的DNA片段或是一个完整克隆。该方法利用两种酶的联合作用:DNA酶I在DNA链上打开缺口


原理

缺口平移是一种将标记核苷酸掺入到DNA中的方法,这些DNA可以是孤立的DNA片段或是一个完整克隆。该方法利用两种酶的联合作用:DNA酶I在DNA链上打开缺口形成3’端轻基,DNA聚合酶I在3’端羟基上加上核苷酸。随着DNA聚合的进行,DNA聚合酶的5'—3'外切核酸酶活性将缺口5'端的核苷酸水解。反应进行过程中标记的和未标记核苷酸掺入,各种大小的DNA片段被合成,但是没有DNA的净合成。产生的双链DNA片段在杂交前必须变性。

材料与仪器

待标记的样品DNA 一般在50μL标记反应中含1μg DNA
荧光素标记的dUTP 工作液浓度为0.2mmol L dATP、dCTP、dGTP、dTTP均0.3mmol L .缺口平移酶混合物 10×缺口平移缓冲液 TAE 缓冲液
水浴锅 PCR仪

步骤


1.制备0.1mmol/L dTTP溶液:将100μL 0.3mmol/L dTTP加入到200μL无核酸酶的水中。


2.制备0.1mmol/L dNTP混合物:将0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP各100μL混合。多余的核苷酸混合物可在-20℃或-80℃保存。


3.对于每个标记反应,在放置在冰上的小离心管中加入1μgDNA、0.2mmol/L荧光基团标记的dUTP 2.5μL、0.1mmol/L dTTP 5μL、0.1mmol/L dNTP混合物10μL、10X缺口平移缓冲液5μL,加无核酸酶的水到40μL


4.每个小离心管中加入缺口平移酶混合物10μL。


5.混匀并稍离心。


6.在15℃条件下温育8〜16h。


7.加入5μL反应终止液。


8.为了去掉未掺入的核苷酸,加入乙酸钠、125μL无水乙醇,用12000r/min的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清。加入100uL70%乙醇,稍振荡,用1500g离心5min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清


9..用真空冷冻干燥器处理样品.10〜20min。用10pLTE重悬沉淀,使终浓度约为100ng/μL。也可以用Sephadex050型离心柱去掉未掺入的核苷酸,操作步骤按照产品说明书进行。用离心柱处理后,标记DNA体积范围为50〜100μL,然后按照步骤8进行浓缩。


10.为了确定标记DNA片段的大小,在50mLTAE或TBE缓冲液中加入0.5g琼脂糖,用微波炉或电热板小心加热至沸腾。当琼脂糖全部溶解,在水浴中降温至55℃。


11.在琼脂糖中加入2.5μL EB混匀后,将琼脂糖倒在具有12孔或16孔梳子的铺胶板上。


12.对于每个标记DNA样品,将2μLDNA(约200ng)、7μL水(TAE或TBE)和1μL上样缓冲液混合。


13.将每个标记样品和分子质量参考在70〜100V下电泳,直至前面的染液在凝胶中迁移约5cm。


14.在紫外投射反射仪上观察DNA,并拍照。大部分的DNA片段应在200〜600bp。


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