缺口平移实验基本方案

1.制备0.1mmol/L dTTP溶液：将100μL 0.3mmol/L dTTP加入到200μL无核酸酶的水中。

2.制备0.1mmol/L dNTP混合物：将0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP各100μL混合。多余的核苷酸混合物可在-20℃或-80℃保存。

3.对于每个标记反应，在放置在冰上的小离心管中加入1μgDNA、0.2mmol/L荧光基团标记的dUTP 2.5μL、0.1mmol/L dTTP 5μL、0.1mmol/L dNTP混合物10μL、10X缺口平移缓冲液5μL，加无核酸酶的水到40μL

4.每个小离心管中加入缺口平移酶混合物10μL。

5.混匀并稍离心。

6.在15℃条件下温育8〜16h。

7.加入5μL反应终止液。

8.为了去掉未掺入的核苷酸，加入乙酸钠、125μL无水乙醇，用12000r/min的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清。加入100uL70%乙醇，稍振荡，用1500g离心5min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清

9..用真空冷冻干燥器处理样品.10〜20min。用10pLTE重悬沉淀，使终浓度约为100ng/μL。也可以用Sephadex050型离心柱去掉未掺入的核苷酸，操作步骤按照产品说明书进行。用离心柱处理后，标记DNA体积范围为50〜100μL，然后按照步骤8进行浓缩。

10.为了确定标记DNA片段的大小，在50mLTAE或TBE缓冲液中加入0.5g琼脂糖，用微波炉或电热板小心加热至沸腾。当琼脂糖全部溶解，在水浴中降温至55℃。

11.在琼脂糖中加入2.5μL EB混匀后，将琼脂糖倒在具有12孔或16孔梳子的铺胶板上。

12.对于每个标记DNA样品，将2μLDNA(约200ng)、7μL水（TAE或TBE)和1μL上样缓冲液混合。

13.将每个标记样品和分子质量参考在70〜100V下电泳，直至前面的染液在凝胶中迁移约5cm。

14.在紫外投射反射仪上观察DNA，并拍照。大部分的DNA片段应在200〜600bp。