RNA的提取及cDNa文库的构建

实验一,Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作: 1,研钵,5ml/10ml/ 25ml移液管,100ml/250ml量筒,250ml/100ml容量瓶,药匙, 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时. 2,50ml/1.5ml离心管,枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃ 20mins 高压灭菌. 电泳槽及电泳托,梳子用3%双氧水处理. 4,常用试剂及其配方: ▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌. ▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC水定容至100ml,室温放置备用. ▲10%肌氨酸钠: 肌氨酸钠 10g 加DEPC水定容至100ml,室温放置备用. ▲变性裂解液: 0.78M柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠 12.375ml 异硫氰酸胍 118.05g 加DEPC水定容至 250ml,室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v) ▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用 ▲3M醋酸钠 PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用 ▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸): MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml 用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用. 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加DEPC水270ml,用时现配. ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油(高压过) 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4℃ 可保持3个月 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶: 称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上. ▲变性电泳缓冲液: 在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml 实验二,动物组织total RNA的提取 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟. 将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片. 根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次. 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟. 冰浴10分钟. 4C,12000g离心20分钟. 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA.蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层. 加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上. 4C,12000g离心20分钟. 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA. 加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟. 4C,12000g离心20分钟. 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟. 4C,12000g离心20分钟. 弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀.4C,12000g离心10分钟. 弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味.用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存. Mg# of tissue 变性裂解液(ml) 2M NaOAC pH 4 (ml) 水饱和酚 (mL) 氯仿 (mL) 异丙醇(mL) 变性裂解液 (mL) 异丙醇(mL) 75% 乙醇(mL) DEPC-treated H20 (mL) 500 5 0.5 5 1 4 0.5 0.5 1 0.5 800 8 0.8 8 1.6 6 0.8 0.8 1 0.8 1000 10 1 10 2 8 1 1 1 1 实验三,植物组织total RNA的提取 先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆.(1g样品加入3ml变性裂解液). 加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀. 加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡. 冰浴10min.4℃,12000g离心10min 小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时. 4℃,12000g离心20min. 去上清,取沉淀.加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中. 4℃,13000rpm离心15min. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀. 4℃,13000rpm离心10min. 取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上. 4℃,13000rpm离心15min. 弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min. 弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味. 用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存. 4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO) 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%. 将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片. 3.室温温育10分钟 . 据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟. 4 C,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中.根据表2加入适量异丙醇,-20 C沉淀1小时以上. (责任编辑：大汉昆仑王)