用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段及单链 DNA 模板进行双脱氧测序实验
材料与仪器dATP 去离子蒸馏水 EDTA 延伸 终止混合液 和示踪混合液 甲酰胺上样缓冲液 Tris-Cl 酶和缓冲液 大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow
材料与仪器
dATP 去离子蒸馏水 EDTA 延伸 终止混合液 和示踪混合液 甲酰胺上样缓冲液 Tris-Cl 酶和缓冲液 大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段 核酸和寡聚核苷酸 寡核苷酸引物 单链 DNA 模板 放射性化合物
离心机和转头 微量离心管或微量滴定板
离心机和转头 微量离心管或微量滴定板
步骤
材料
缓冲液和溶液
试剂、缓冲液，储液的组成参见附录 1, 储液使用前稀释到适当浓度。
dATP(0.1 mmol/L)
可选，参见步骤 4。
去离子蒸馏水
EDTA(10 mmol/L,pH8.0)
延伸/终止混合液和示踪混合液
这些反应混合液可通过混合 dNTP 和 ddNTP 储液制备，参见表 12-7。
甲酰胺上样缓冲液
TM 缓冲液
100 mmol/LTris-Cl(pH8.5)
50 mmol/LMgCl2
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段（5u/ul)
每一套四种双脱氧测序反应大约需 2.5 单位酶。Klenow 片段通常保存在含 50% 甘油的缓冲液中。测序反应中过量使用酶会导致测序凝胶畸变，因为甘油与制备凝胶和凝胶电泳的标准缓冲液 TBE 中的硼酸盐离子相互作用（请参见本方案末尾疑难解答）。
核酸和寡聚核苷酸
dNTP、ddNTP、dNTP(1 mmol/L) 和 ddNTP(5 mmol/L) 储液
寡核苷酸引物
浓度约为 0.5pmol/ul(约 3.3ng/ul), 溶于水中。
对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物，可参见第 8 章信息栏“通用引物”及本章末信息栏“DNA 测序寡核苷酸引物储液制备"。
单链 DNA 模板
浓度约 0.05pmol/ul, 相当于约 0.15ug/ul 的 M13 噬菌体单链 DNA。
小规模制备 M13 噬菌体重组子单链 DNA 的浓度一般在 0.05 到 0.5ug/ml 范围内。这取决于特定噬菌体的生校速度。在正常的测序反应条件下，模板 DNA 是过量的。因而每次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末疑难答。
放射性化合物
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-33P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-35S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml) 或
5'32P 标记的寒核苷酸引物
若不用放射性标记 dATf 作为内标记，也可以用 5’端以 32P 标记的寡核苷酸引物进行测序反应。此时，可用 2ul(约 5x105cpm 约 0.5ng）放射性标记引物和 2ul 水代替反应中的未标记引物和 [32P]dATP(步骤 4), 其他的步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 转移至寡核苷酸 5'端。详细情況见第 10 章的方案 2。
离心机和转头
离心转头或用于 0.5 ml 微量离心管的衔接头，以及甩平式转头和微量滴定板架 (如 Sorvall 公司产品），聚苯乙烯泡沫或橡胶衬垫。
专用设备
微量离心管（0.5 ml) 或微量滴定板（柔韧，耐热，每孔容量为 300ul 的 U 型底 96 孔扳）。
参见信息栏"微量滴定板'
方法
1. 在 0.5 ml 微量离心管或微量滴定板孔中加入：
单链模板 DNA(0.1ug/ul) 5ul
寡核苷酸引物（1ug/ml, 约 160pmol/m]) 4ul
TM 缓冲液 1ul
2. 封闭试管的顶端或密封微量滴定板，在 55°C 温育反应混合液 5~10 min, 使寡聚核苷酸引物与 DNA 模板退火。若有必要，退火的模板和引物可在-20°C 下保藏几个月。
3. 用字母 C、T、A、G 标记四个微量心管或 96 孔 U 型微量滴定板上四个毗连的小孔; 然后在每个小管中加入 4ul 相应的 ddNTP 延伸/终止混合液（例如在标记 C 的微量离心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddCTP 混合液，在标记 T 的微量离心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddTTP 混合液等)。
4. 把退火后的引物模板溶液放在冰上并加入：
[α-32P]dATP 或 [α-33P]dATP 或 [α-35S]dATP 1ul
Klenow 酶（约 2.5 单位） 1ul
0~1 mmol/LdATP(如使用 [α-32P] 或 [α-33P]) 1ul
或
水（如使用 [α-35S]dATP) 1ul
Klenow 酶应储存在不要使其升到室温。酶在冰桶中几小时会丧失活性。
5. 取步骤 4 的混合液 3ul 加到每一个 C、T、A、G 管的管壁上或微量滴定板孔的边上。不要让放射性标记混合液与 ddNTP 延伸/终止混合液接触。加入的液体应挂在管或孔靠近边缘的壁上。
6. 把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或适合 0.5 ml 离心管的衔接头，或把它们放入去盖的 1.5 ml 离心管中），或者把微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机中，以 2000r/min 转速离心 C、T、A 和 G 各管或滴定板几秒钟，混合反应物。开始延伸/终止反应。37°C 温育 10~12 min。
在室温至 37°C 温度范围内.Klenow 酶都能很好地催化延伸/终止反应和示踪反应。
7. 溫育后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 1ul 的示踪液。总共温育 10~12 min 后，离心 2s, 使示踪液混入到延伸/终止反应液中。再在室温下温育 10~12 min。
8. 第二次温育 9~11 min 后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 6ul 甲酰胺上样缓冲液。不要让溶液滑入聚合反应液中。温育结束，离心微量离心管或微量滴定板终止测序反应。
9. 反应物在-20°C 时可最多保存 5 天，也可以用变凝胶电泳直接分析见方案 8、9 或 10、11 和 12)。热变性后（100°C,2 min), 在冰上快速冷却。取 C、T、A 和 G 反应物各 3ul 加入测序凝胶各孔中。
缓冲液和溶液
试剂、缓冲液，储液的组成参见附录 1, 储液使用前稀释到适当浓度。
dATP(0.1 mmol/L)
可选，参见步骤 4。
去离子蒸馏水
EDTA(10 mmol/L,pH8.0)
延伸/终止混合液和示踪混合液
这些反应混合液可通过混合 dNTP 和 ddNTP 储液制备，参见表 12-7。
甲酰胺上样缓冲液
TM 缓冲液
100 mmol/LTris-Cl(pH8.5)
50 mmol/LMgCl2
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKienow 片段（5u/ul)
每一套四种双脱氧测序反应大约需 2.5 单位酶。Klenow 片段通常保存在含 50% 甘油的缓冲液中。测序反应中过量使用酶会导致测序凝胶畸变，因为甘油与制备凝胶和凝胶电泳的标准缓冲液 TBE 中的硼酸盐离子相互作用（请参见本方案末尾疑难解答）。
核酸和寡聚核苷酸
dNTP、ddNTP、dNTP(1 mmol/L) 和 ddNTP(5 mmol/L) 储液
寡核苷酸引物
浓度约为 0.5pmol/ul(约 3.3ng/ul), 溶于水中。
对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物，可参见第 8 章信息栏“通用引物”及本章末信息栏“DNA 测序寡核苷酸引物储液制备"。
单链 DNA 模板
浓度约 0.05pmol/ul, 相当于约 0.15ug/ul 的 M13 噬菌体单链 DNA。
小规模制备 M13 噬菌体重组子单链 DNA 的浓度一般在 0.05 到 0.5ug/ml 范围内。这取决于特定噬菌体的生校速度。在正常的测序反应条件下，模板 DNA 是过量的。因而每次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末疑难答。
放射性化合物
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-33P]dATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml) 或
[a-35S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml) 或
5'32P 标记的寒核苷酸引物
若不用放射性标记 dATf 作为内标记，也可以用 5’端以 32P 标记的寡核苷酸引物进行测序反应。此时，可用 2ul(约 5x105cpm 约 0.5ng）放射性标记引物和 2ul 水代替反应中的未标记引物和 [32P]dATP(步骤 4), 其他的步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 转移至寡核苷酸 5'端。详细情況见第 10 章的方案 2。
离心机和转头
离心转头或用于 0.5 ml 微量离心管的衔接头，以及甩平式转头和微量滴定板架 (如 Sorvall 公司产品），聚苯乙烯泡沫或橡胶衬垫。
专用设备
微量离心管（0.5 ml) 或微量滴定板（柔韧，耐热，每孔容量为 300ul 的 U 型底 96 孔扳）。
参见信息栏"微量滴定板'
方法
1. 在 0.5 ml 微量离心管或微量滴定板孔中加入：
单链模板 DNA(0.1ug/ul) 5ul
寡核苷酸引物（1ug/ml, 约 160pmol/m]) 4ul
TM 缓冲液 1ul
2. 封闭试管的顶端或密封微量滴定板，在 55°C 温育反应混合液 5~10 min, 使寡聚核苷酸引物与 DNA 模板退火。若有必要，退火的模板和引物可在-20°C 下保藏几个月。
3. 用字母 C、T、A、G 标记四个微量心管或 96 孔 U 型微量滴定板上四个毗连的小孔; 然后在每个小管中加入 4ul 相应的 ddNTP 延伸/终止混合液（例如在标记 C 的微量离心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddCTP 混合液，在标记 T 的微量离心管或微量滴定板孔中加入 4ul ddTTP 混合液等)。
4. 把退火后的引物模板溶液放在冰上并加入：
[α-32P]dATP 或 [α-33P]dATP 或 [α-35S]dATP 1ul
Klenow 酶（约 2.5 单位） 1ul
0~1 mmol/LdATP(如使用 [α-32P] 或 [α-33P]) 1ul
或
水（如使用 [α-35S]dATP) 1ul
Klenow 酶应储存在不要使其升到室温。酶在冰桶中几小时会丧失活性。
5. 取步骤 4 的混合液 3ul 加到每一个 C、T、A、G 管的管壁上或微量滴定板孔的边上。不要让放射性标记混合液与 ddNTP 延伸/终止混合液接触。加入的液体应挂在管或孔靠近边缘的壁上。
6. 把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或适合 0.5 ml 离心管的衔接头，或把它们放入去盖的 1.5 ml 离心管中），或者把微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机中，以 2000r/min 转速离心 C、T、A 和 G 各管或滴定板几秒钟，混合反应物。开始延伸/终止反应。37°C 温育 10~12 min。
在室温至 37°C 温度范围内.Klenow 酶都能很好地催化延伸/终止反应和示踪反应。
7. 溫育后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 1ul 的示踪液。总共温育 10~12 min 后，离心 2s, 使示踪液混入到延伸/终止反应液中。再在室温下温育 10~12 min。
8. 第二次温育 9~11 min 后，沿每一个 C、T、A、G 管或孔壁加入 6ul 甲酰胺上样缓冲液。不要让溶液滑入聚合反应液中。温育结束，离心微量离心管或微量滴定板终止测序反应。
9. 反应物在-20°C 时可最多保存 5 天，也可以用变凝胶电泳直接分析见方案 8、9 或 10、11 和 12)。热变性后（100°C,2 min), 在冰上快速冷却。取 C、T、A 和 G 反应物各 3ul 加入测序凝胶各孔中。
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