CTAB法(植物组织制备基因组 DNA 实验)
原理加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提
原理
加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。
材料与仪器
植物组织
CTAB液 2-疏基乙醇 TE 高盐TE 氯仿 异戊醇
研钵 离心机 培养箱
CTAB液 2-疏基乙醇 TE 高盐TE 氯仿 异戊醇
研钵 离心机 培养箱
步骤
1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇,使终浓度达2%。将此溶液及CTAB溶液加热至65℃。
2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷却粉碎器/匀浆器,将植物组织粉碎成为细粉。
3. 将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
4. 往粉碎的组织中加人预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育10~60 min,混匀。
3. 将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
4. 往粉碎的组织中加人预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育10~60 min,混匀。
5. 用等体积的24:1氯仿/辛醇或氯仿/异戊醇抽提匀浆液,颠倒使充分混合。
6. 于4℃7 500 g 离心5 min,回收上(水)相。
7. 在回收的上层相中加入1/10体积的的65℃的CTAB溶液,颠倒混匀。
8. 用等体积的氯仿/辛醇抽提,混匀,离心,回收上(水)相。
6. 于4℃7 500 g 离心5 min,回收上(水)相。
7. 在回收的上层相中加入1/10体积的的65℃的CTAB溶液,颠倒混匀。
8. 用等体积的氯仿/辛醇抽提,混匀,离心,回收上(水)相。
9. 加入正好1体积的CTAB沉淀液,颠倒混匀,如果沉淀可见,继续做步骤10,否则于65℃温育30min。
10. 于4℃,500 g 离心5 min。
10. 于4℃,500 g 离心5 min。
11. 移出上清,但不要丢弃,用高盐的TE缓沖液重悬沉淀。
12. 如果沉淀难于重悬,于65℃温育30 min,重复直至所有的或大部分沉淀溶解。
13. 加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸,充分混匀,于4℃,7 500 g 离心15min。
14. 用80%乙醇洗涤沉淀物,干燥,用尽可能少的缓冲液重悬。
12. 如果沉淀难于重悬,于65℃温育30 min,重复直至所有的或大部分沉淀溶解。
13. 加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸,充分混匀,于4℃,7 500 g 离心15min。
14. 用80%乙醇洗涤沉淀物,干燥,用尽可能少的缓冲液重悬。