RNA 干扰技术

转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNAi），与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。

目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解（如Dicer，E.coli的RNA酶II）体外制备 siRNA，以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

前面的3种方法主要都是体外制备siRNA，并且需要专门的RNA转染试剂将 siRNA转到细胞内。

而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNA。

这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

而将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的方法不外乎以下几种：

磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（polybrene）、机械法［如显微注射和基因枪（biolistic particle）］和阳离子脂质体介导的转染。

器材：

①PCR仪、（灭菌）

②细胞培养箱、恒温水浴箱

③紫外分光光度计

④显微镜

⑤35 mm细胞培养皿

⑥冷冻离心机

⑦0.2 ml和1.5 ml聚苯乙烯 Eppendorf 管

试剂：

①材料：指数生长的哺乳动物细胞培养物

②siRNA表达框架的PCR模板、上游引物、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、10 x PCR反应缓冲液

③Lipofectamine 2000

④细胞生长培养基、无血清培养基、0.25％ 胰蛋白酶

⑤3 mol／L CH3COONa（pH 5.2）

⑥TE（pH 8.0）

RNAi的基本过程可分为如下几步：

(一) 试剂配制

（1）上游引物 浓度20 μmol／L。

（2）dNTP混合液 将 dATP、dGTP、dCTP和dTTP钠盐各100 mg合并，加去离子水2 ml溶解，用0.1 mol／L NaOH 调节 pH至7.0～7.5，使其浓度为5 mmol／L，分装后-20 ℃ 保存。现也有商品化的混合液（各2 mmol／L）供应。

（3）Taq DNA聚合酶 5 U／μl，使用时其在50 μl反应体积终浓度为1～2.5 U。

（4）10 x PCR反应缓冲液 500 mmol/L KCI，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4), 15 mmol/L MgCl2。

（5）10 x D-Hanks缓冲液 NaCl 80.0 g，Na2HPO4·2H2O 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，三蒸水加至1000 ml，高压灭菌后4 ℃ 保存。用时按比例稀释。

（6）0.25％ 胰蛋白酶 胰蛋白酶0.25 g，D-Hanks缓冲液加至100 ml溶解，过滤除菌，4 ℃保存，用前在37 ℃下回温。

（7）无血清培养基（RPMI-1640 基础培养基）三蒸水900 ml，RPMI-1640粉1包（10.4 g），磁场搅拌至完全溶解，加入NaHCO3 2.0 g，完全溶解后加水定容到1000 ml，过滤除菌分装。

（8）细胞生长培养基（RPMI-1640生长培养基）RPMI-1640基础培养基添加10％ 小牛血清。

（10） 3 mol／L CH3COONa（pH 5.2） 800 ml H2O溶解408.3 g CH3COONa，用冰醋酸 调节pH至5.0，用H2O定容至1 L，高压蒸汽灭菌。

(二) siRNA的设计（RNAi目标序列的选取原则）

（1）从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二联序列，并记下其3＇端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

有研究结果显示（G＋C）含量在45％～55％左右的siRNA要比那些（G＋C）含量偏高的更为有效。

建议在设计siRNA时不要针对5＇和3＇端的非编码区（untranslated regions，UTR），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA，从而影响siRNA的效果。

（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人、小鼠、大鼠等）进行比较，排除那些和其他编码序列／EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih／gov／BLAST）。

（3）选出合适的目标序列设计并分别合成正义RNA和反义RNA的下游引物，合成浓度20 μmol／L。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，并合成相应的引物，以找到最有效的siRNA序列。

(三) PCR反应

（1）向一个Eppendorf管中加入10 x PCR缓冲液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 ul，上游引物1.5 μl，下游引物（S）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，灭菌去离子水补足50 μl；

另一个 Eppendorf 管中加入10xPCR缓冲液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 μl，上游引物1.5 μl，下游引物（AS）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，灭菌去离子水补足50 μl。

（2）在PCR仪上进行两步扩增反应：94 ℃，变性30 s；72 ℃，90 s，35个循环。

(四) PCR产物的纯化

（1）分别在两种PCR产物中加入1／5体积的3 mol／L CH3COONa和2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀后，4 ℃放置30 min。

（2）4 ℃，14000 g离心5 min液，吸去上清液，然后用70％ 乙醇洗涤沉淀的DNA，再次离心样品，弃去上清液，空气干燥沉淀。

（3）将沉淀下来的DNA溶于TE，测OD值。

(五) 转染

（1）转染前一天，0.25％ 胰蛋白酶消化细胞并计数，以5x104个细胞／平皿的密度将细胞平铺于35 mm细胞培养皿上，使其在转染日密度不低于70％。加3 ml含血清、不含抗生素的生长培养基，于含5％～7％ CO2的37℃ 培养箱内孵育20～24 h。

（2）在一个聚苯乙烯试管内用100 μl无血清培养基稀释1.0～2.0 μg PCR产物。

（3）在另一个聚苯乙烯试管内用100 μl无血清培养基稀释2～5 μl Lipofectamine2000试剂。Lipofectamine2000稀释后，在30 min内同稀释的PCR产物混合。保温时间过长会降低活性。

（4）混合稀释的PCR产物和稀释的 Lipofectamine2000，混匀后在室温下孵育20 min。

（5）孵育DNA-脂质体溶液时，用无血清培养基将要转染的细胞洗涤3次，然后向平皿中加入0.5 ml无血清培养基，将组织培养皿再放入含5％～7％CO2的37℃培养箱内孵育。

（6）直接将复合物加入到平皿中，摇动平皿，轻轻混匀。

（7）将平皿放在含5％～7％ CO2的37 ℃培养箱内孵育24～48 h，无需去掉复合物或更换培养基，或者在4～5 h后更换生长培养基也不会降低转染活性。

（8）在细胞中加入复合物24～72 h后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。

对稳定表达，在开始转染1d后将细胞传代至新鲜培养基中，2d后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

(六) 实验结果及分析

1．要设立阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。

通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

2．避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致 siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

3．健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4．避免使用抗生素

从细胞种植到转染后72h期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。

这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。

5．通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48h后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以致死亡。

6．通过标记siRNA来优化实验