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RNA实验

RNA 干扰技术

2024-06-13 RNA实验 加入收藏
简介转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),与mRNA对应的正义RN


简介

转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。

目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解(如Dicer,E.coli的RNA酶II)体外制备 siRNA,以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

前面的3种方法主要都是体外制备siRNA,并且需要专门的RNA转染试剂将 siRNA转到细胞内。

而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNA。

这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

而将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的方法不外乎以下几种:

磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、机械法[如显微注射和基因枪(biolistic particle)]和阳离子脂质体介导的转染。

原理

siRNA 表达框架制备siRNA法的基本原理是:siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SEC)是一种由PCR得到的 siRNA表达模板,包括一个RNA聚合酶I启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA聚合酶II终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中,具体过程如图所示。
阳离子脂质体介导的转染的基本原理为:脂类的头部基团之间的离子相互作用,脂类的头部基团携带很强的正电荷,可中和DNA磷酸基团的负电荷,因而阳离子脂类可以与DNA自动形成可与细胞膜融合的单层外壳,从而将DNA导入细胞内。

材料与仪器

器材:

①PCR仪、(灭菌)

②细胞培养箱、恒温水浴箱

③紫外分光光度计

④显微镜

⑤35 mm细胞培养皿

⑥冷冻离心机

⑦0.2 ml和1.5 ml聚苯乙烯 Eppendorf 管

试剂:

①材料:指数生长的哺乳动物细胞培养物

②siRNA表达框架的PCR模板、上游引物、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、10 x PCR反应缓冲液

③Lipofectamine 2000

④细胞生长培养基、无血清培养基、0.25% 胰蛋白酶

⑤3 mol/L CH3COONa(pH 5.2)

⑥TE(pH 8.0)

⑦无水乙醇、70% 乙醇

步骤

RNAi的基本过程可分为如下几步:

(一) 试剂配制

(1)上游引物 浓度20 μmol/L。

(2)dNTP混合液 将 dATP、dGTP、dCTP和dTTP钠盐各100 mg合并,加去离子水2 ml溶解,用0.1 mol/L NaOH 调节 pH至7.0~7.5,使其浓度为5 mmol/L,分装后-20 ℃ 保存。现也有商品化的混合液(各2 mmol/L)供应。

(3)Taq DNA聚合酶 5 U/μl,使用时其在50 μl反应体积终浓度为1~2.5 U。

(4)10 x PCR反应缓冲液 500 mmol/L KCI,100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4), 15 mmol/L MgCl2

(5)10 x D-Hanks缓冲液 NaCl 80.0 g,Na2HPO4·2H2O 0.6 g,KCl 4.0 g,KH2PO4 0.6 g,三蒸水加至1000 ml,高压灭菌后4 ℃ 保存。用时按比例稀释。

(6)0.25% 胰蛋白酶 胰蛋白酶0.25 g,D-Hanks缓冲液加至100 ml溶解,过滤除菌,4 ℃保存,用前在37 ℃下回温。

(7)无血清培养基(RPMI-1640 基础培养基)三蒸水900 ml,RPMI-1640粉1包(10.4 g),磁场搅拌至完全溶解,加入NaHCO2.0 g,完全溶解后加水定容到1000 ml,过滤除菌分装。

(8)细胞生长培养基(RPMI-1640生长培养基)RPMI-1640基础培养基添加10% 小牛血清。

(9) TE 10 mmol/L Tris-HC1,1 mmol/L EDTA,pH 8.0。

(10) 3 mol/L CH3COONa(pH 5.2) 800 ml H2O溶解408.3 g CH3COONa,用冰醋酸 调节pH至5.0,用H2O定容至1 L,高压蒸汽灭菌。

(二) siRNA的设计(RNAi目标序列的选取原则)

(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二联序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。

有研究结果显示(G+C)含量在45%~55%左右的siRNA要比那些(G+C)含量偏高的更为有效。

建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTR),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA,从而影响siRNA的效果。

(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih/gov/BLAST)。

(3)选出合适的目标序列设计并分别合成正义RNA和反义RNA的下游引物,合成浓度20 μmol/L。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,并合成相应的引物,以找到最有效的siRNA序列。

(三) PCR反应

(1)向一个Eppendorf管中加入10 x PCR缓冲液5 μl,5 mmol/L dNTP混合液2 ul,上游引物1.5 μl,下游引物(S)1.5 μl,模板DNA 1 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,灭菌去离子水补足50 μl;

另一个 Eppendorf 管中加入10xPCR缓冲液5 μl,5 mmol/L dNTP混合液2 μl,上游引物1.5 μl,下游引物(AS)1.5 μl,模板DNA 1 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,灭菌去离子水补足50 μl。

(2)在PCR仪上进行两步扩增反应:94 ℃,变性30 s;72 ℃,90 s,35个循环。

(四) PCR产物的纯化

(1)分别在两种PCR产物中加入1/5体积的3 mol/L CH3COONa和2倍体积的预冷无水乙醇,充分混匀后,4 ℃放置30 min。

(2)4 ℃,14000 g离心5 min液,吸去上清液,然后用70% 乙醇洗涤沉淀的DNA,再次离心样品,弃去上清液,空气干燥沉淀。

(3)将沉淀下来的DNA溶于TE,测OD值。

(五) 转染

(1)转染前一天,0.25% 胰蛋白酶消化细胞并计数,以5x104个细胞/平皿的密度将细胞平铺于35 mm细胞培养皿上,使其在转染日密度不低于70%。加3 ml含血清、不含抗生素的生长培养基,于含5%~7% CO2的37℃ 培养箱内孵育20~24 h。

(2)在一个聚苯乙烯试管内用100 μl无血清培养基稀释1.0~2.0 μg PCR产物。

(3)在另一个聚苯乙烯试管内用100 μl无血清培养基稀释2~5 μl Lipofectamine2000试剂。Lipofectamine2000稀释后,在30 min内同稀释的PCR产物混合。保温时间过长会降低活性。

(4)混合稀释的PCR产物和稀释的 Lipofectamine2000,混匀后在室温下孵育20 min。

(5)孵育DNA-脂质体溶液时,用无血清培养基将要转染的细胞洗涤3次,然后向平皿中加入0.5 ml无血清培养基,将组织培养皿再放入含5%~7%CO2的37℃培养箱内孵育。

(6)直接将复合物加入到平皿中,摇动平皿,轻轻混匀。

(7)将平皿放在含5%~7% CO2的37 ℃培养箱内孵育24~48 h,无需去掉复合物或更换培养基,或者在4~5 h后更换生长培养基也不会降低转染活性。

(8)在细胞中加入复合物24~72 h后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。

对稳定表达,在开始转染1d后将细胞传代至新鲜培养基中,2d后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

(六) 实验结果及分析

根据所要沉默的基因其表达的蛋白质的性质,选择相应的方法检测蛋白质的表达情况。

注意事项

1.要设立阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。

通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致 siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4.避免使用抗生素

从细胞种植到转染后72h期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。

这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。

5.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48h后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以致死亡。

6.通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA 能用来分析 siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。


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