制备体外剪接反应用HeLa细胞核和胞质S100提取物实验
原理胞核提取物可以用于前体 mRNA 的剪接，S100 提取物中虽然包括许多剪接因子，但它不具有剪接活性，因为它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不过该提取物
原理
胞核提取物可以用于前体 mRNA 的剪接，S100 提取物中虽然包括许多剪接因子，但它不具有剪接活性，因为它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白，不过该提取物中补充一种或多种 SR 蛋白后就可以进行有效的剪接。
材料与仪器
HeLa 细胞
DTT 苯甲基磺酰氟 PBS 缓冲液
Eagle 悬浮培养基本培养基 玻璃勾架器 透析袋
DTT 苯甲基磺酰氟 PBS 缓冲液
Eagle 悬浮培养基本培养基 玻璃勾架器 透析袋
步骤
―、材料与设备
所有的试剂均需用高质量高压灭菌水配制，例如 Mill Q ( Millipore，Bedford，MA，USA ) 或者双燕馏水。所有用于培养细胞的成分均需高压灭菌，不耐热的材料用 0.22 μm 过滤器过滤除菌。
1. HeLa 细胞悬浮培养
(1) 培养基：Joklik 修改后的 Eagle 悬浮培养基本培养基（ICN Pharmaceuticals 公司），或相当的培养基，这种粉末状的培养基包含除血淸外的所有必须物质。用 Milli Q 水溶解粉末并过滤除菌，配制成 5X 储备液，用过滤除菌水配制工作液并加入小牛血清至 终浓度为 50 ml/L，pH 约 7.0。
(2) HeLa 细胞：用适于在悬浮培养基中生长的细胞株，如 S-3 株。
2. 提取物的制备
试剂 (1) 和 (2) 储存液应保存于 -20℃，在使用前再加入溶液 (3)~(6)。
(1) 1 mol/L DTT。
(2) 20 mg/ml（115 mmol/L ) 苯甲基磺酰氟（PMSF)，溶于乙醇。
(3) PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgCl2。
(4) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT。
(5) 缓冲液 B：0.3 mol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，1.4 mol/L KCl，30 mmol/L MgCl2。
(6) 缓冲液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，0.6 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，25%（V/V）甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(7) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，20% ( V/V )甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(8) 40 ml Dounce 带较松研杵的玻璃勾架器。
(9) 截留分子质量为 12000~14000 Da 的透析袋。
二、操作方法
1. HeLa 细胞悬浮培养
细胞于 37℃ 在转动培养瓶中培养，细胞密度维持在 2X105~5X105。细胞倍增时间大约是 24 h，细胞密度可用血细胞计数器计数。
2. HeLa 细胞核提取物的制备
(1) 取对数生长期（4X105~6X105/ml，不超过 1X106/ml）的 HeLa 细胞用低速离心机在 1800 g 离心 10 min，收集细胞。
(2) 用冰冷的 PBS 轻轻地重悬细胞，再离心，确定细胞沉淀的体积（PCV )。后面所有的步骤都应该在冰上或者在冷室里进行，所有的离心步骤应该在 4℃ 进行。
(3) 将细胞沉淀轻轻地重悬在 5 倍 PCV 的缓冲液 A 中，冰上放置 10 min，使细胞在低渗缓冲液中膨胀。
(4) 于 1800 g 离心 10 min，沉淀细胞。再用 2 倍 PCV 的缓冲液 A 重悬细胞。由于膨胀，细胞沉淀体积会加倍，计算时釆用原来的 PCV。
(5) 用 Dounce 玻璃匀浆器匀浆大约 10 次。细胞裂解的程度通过台盼蓝染色以血细胞计数器检测，目标是 90% 的细胞裂解，但匀浆不要超过必需的次数。注意 HeLa 细胞核很大，并不比完整的细胞小多少。
(6) 裂解液转入高速离心管中，于 1200 g 离心 10 min，用吸管小心取出上清加入一个量筒中以制备 S100 提取物。
(7) 在同一离心管中以 33000 g 离心 20 min，小心吸弃上清。
(8) 12 升 HeLa 细胞培养物获得的浓缩胞核体积（PNV ) 通常为 9~15 ml。加 2 ml 缓冲液 C，旋动以使沉淀与离心管分离，但是不要使沉淀散开，将沉淀和液体转移到带刻度的一次性试管，测量体积，然后减去 2 ml 为估计的 PNV，加入更多缓冲液 C ( 含 0.6 mol/L KCl ) 使 KCl 的终浓度为 0.24 mol/L，其范围应该为 0.20~0.25 mol/L。
(9) 将沉淀和缓冲液（还不要将沉淀重悬，否则溶液将变得黏稠且很难没有损失地转移 ) 转移到一个干净的 40 ml 玻璃 Bounce 匀浆器中，用一个较松的研杵匀浆几次使之悬浮。匀浆 10 次应该足以制备匀质的悬液。
(10) 将匀浆转移到一个或多个带螺帽的高速离心试管中并轻轻晃动混合 30~45 min。
(11) 高速离心（约 33000 g，30 min）沉淀盐洗过的细胞核，并小心地将上清转移到一次性试管中，避免沉淀的污染。
(12) 用缓冲液 D 透析上淸两次（通常用 1~2 L）。一次过夜，另一次至少 4 h。
(13) 33000 g 高速离心 20 min，去除透析过程中形成的沉淀，并小心地将上清（核提取物）转移到一次性试管中。
(14) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中。将离心管放入液氮中快速冷冻，于 -70°C 或更低温度储存。
3. HeLa 细胞胞质 S100 提取物的制备
在等待操作1 "HeLa 细胞核提取物的制备" 中的步骤 (7) 的离心时，将第 (6) 步得到的上清进步处理可获得 S100 提取物，它包括胞质成分和许多（但非全部）核成分，它在低渗缓冲溶液 A 中提取。
(1) 测量上请液的体积，加 0.11 倍体积的缓冲液 B，轻轻混合。
(2) 在超速离心管中以 100000 g 离心 1 h。
(3) 将上清转入一次性试管中。
(4) 用缓冲液 D 透析 2 次，一次过夜，另一次至少 4 h。提取物的体积在透析期间显著缩小，这是因为缓冲液 D 中含有的甘油使提取物浓缩。
(5) 33000 g 高速离心 20 min 去除不溶物质。
(6) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中，快速冷冻并如操作3 “HeLa 细胞核提取物的制备” 中的步骤 (14) 所述储存。12 升培养物可制备胞质 S100 提取物 40~55 ml，总蛋白浓度为 10~15 mg/ml 提取物活性可保持数年之久。
所有的试剂均需用高质量高压灭菌水配制，例如 Mill Q ( Millipore，Bedford，MA，USA ) 或者双燕馏水。所有用于培养细胞的成分均需高压灭菌，不耐热的材料用 0.22 μm 过滤器过滤除菌。
1. HeLa 细胞悬浮培养
(1) 培养基：Joklik 修改后的 Eagle 悬浮培养基本培养基（ICN Pharmaceuticals 公司），或相当的培养基，这种粉末状的培养基包含除血淸外的所有必须物质。用 Milli Q 水溶解粉末并过滤除菌，配制成 5X 储备液，用过滤除菌水配制工作液并加入小牛血清至 终浓度为 50 ml/L，pH 约 7.0。
(2) HeLa 细胞：用适于在悬浮培养基中生长的细胞株，如 S-3 株。
2. 提取物的制备
试剂 (1) 和 (2) 储存液应保存于 -20℃，在使用前再加入溶液 (3)~(6)。
(1) 1 mol/L DTT。
(2) 20 mg/ml（115 mmol/L ) 苯甲基磺酰氟（PMSF)，溶于乙醇。
(3) PBS：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na2HPO4，1.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgCl2。
(4) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0)，10 mmoI/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT。
(5) 缓冲液 B：0.3 mol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，1.4 mol/L KCl，30 mmol/L MgCl2。
(6) 缓冲液 C：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，0.6 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，25%（V/V）甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(7) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0 )，100 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，20% ( V/V )甘油，0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT。
(8) 40 ml Dounce 带较松研杵的玻璃勾架器。
(9) 截留分子质量为 12000~14000 Da 的透析袋。
二、操作方法
1. HeLa 细胞悬浮培养
细胞于 37℃ 在转动培养瓶中培养，细胞密度维持在 2X105~5X105。细胞倍增时间大约是 24 h，细胞密度可用血细胞计数器计数。
2. HeLa 细胞核提取物的制备
(1) 取对数生长期（4X105~6X105/ml，不超过 1X106/ml）的 HeLa 细胞用低速离心机在 1800 g 离心 10 min，收集细胞。
(2) 用冰冷的 PBS 轻轻地重悬细胞，再离心，确定细胞沉淀的体积（PCV )。后面所有的步骤都应该在冰上或者在冷室里进行，所有的离心步骤应该在 4℃ 进行。
(3) 将细胞沉淀轻轻地重悬在 5 倍 PCV 的缓冲液 A 中，冰上放置 10 min，使细胞在低渗缓冲液中膨胀。
(4) 于 1800 g 离心 10 min，沉淀细胞。再用 2 倍 PCV 的缓冲液 A 重悬细胞。由于膨胀，细胞沉淀体积会加倍，计算时釆用原来的 PCV。
(5) 用 Dounce 玻璃匀浆器匀浆大约 10 次。细胞裂解的程度通过台盼蓝染色以血细胞计数器检测，目标是 90% 的细胞裂解，但匀浆不要超过必需的次数。注意 HeLa 细胞核很大，并不比完整的细胞小多少。
(6) 裂解液转入高速离心管中，于 1200 g 离心 10 min，用吸管小心取出上清加入一个量筒中以制备 S100 提取物。
(7) 在同一离心管中以 33000 g 离心 20 min，小心吸弃上清。
(8) 12 升 HeLa 细胞培养物获得的浓缩胞核体积（PNV ) 通常为 9~15 ml。加 2 ml 缓冲液 C，旋动以使沉淀与离心管分离，但是不要使沉淀散开，将沉淀和液体转移到带刻度的一次性试管，测量体积，然后减去 2 ml 为估计的 PNV，加入更多缓冲液 C ( 含 0.6 mol/L KCl ) 使 KCl 的终浓度为 0.24 mol/L，其范围应该为 0.20~0.25 mol/L。
(9) 将沉淀和缓冲液（还不要将沉淀重悬，否则溶液将变得黏稠且很难没有损失地转移 ) 转移到一个干净的 40 ml 玻璃 Bounce 匀浆器中，用一个较松的研杵匀浆几次使之悬浮。匀浆 10 次应该足以制备匀质的悬液。
(10) 将匀浆转移到一个或多个带螺帽的高速离心试管中并轻轻晃动混合 30~45 min。
(11) 高速离心（约 33000 g，30 min）沉淀盐洗过的细胞核，并小心地将上清转移到一次性试管中，避免沉淀的污染。
(12) 用缓冲液 D 透析上淸两次（通常用 1~2 L）。一次过夜，另一次至少 4 h。
(13) 33000 g 高速离心 20 min，去除透析过程中形成的沉淀，并小心地将上清（核提取物）转移到一次性试管中。
(14) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中。将离心管放入液氮中快速冷冻，于 -70°C 或更低温度储存。
3. HeLa 细胞胞质 S100 提取物的制备
在等待操作1 "HeLa 细胞核提取物的制备" 中的步骤 (7) 的离心时，将第 (6) 步得到的上清进步处理可获得 S100 提取物，它包括胞质成分和许多（但非全部）核成分，它在低渗缓冲溶液 A 中提取。
(1) 测量上请液的体积，加 0.11 倍体积的缓冲液 B，轻轻混合。
(2) 在超速离心管中以 100000 g 离心 1 h。
(3) 将上清转入一次性试管中。
(4) 用缓冲液 D 透析 2 次，一次过夜，另一次至少 4 h。提取物的体积在透析期间显著缩小，这是因为缓冲液 D 中含有的甘油使提取物浓缩。
(5) 33000 g 高速离心 20 min 去除不溶物质。
(6) 将提取物以 0.1~1 ml 分装到微量离心管中，快速冷冻并如操作3 “HeLa 细胞核提取物的制备” 中的步骤 (14) 所述储存。12 升培养物可制备胞质 S100 提取物 40~55 ml，总蛋白浓度为 10~15 mg/ml 提取物活性可保持数年之久。
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