天然RNA文库筛选与蛋白特异性结合的RNA序列实验
原理细胞中，蛋白质与 RNA 结合参与多种生理调控和发育过程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外运，翻译起始及降解等过程中都存在着蛋白质与 RNA
原理
细胞中，蛋白质与 RNA 结合参与多种生理调控和发育过程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外运，翻译起始及降解等过程中都存在着蛋白质与 RNA 的直接相互作用。在发育的各个阶段，RNA 结合蛋白可以通过与 mRNA 的相互作用调控基因的表达。
材料与仪器
mRNA 寡核苷酸
工具酶 二硫苏糖醇 无核酸酶去离子水 乙酸钾 PCI 溶液 NT2 缓冲液 KNET 缓冲液
微离心管及加样器吸头 Sephadex G-50 柱
工具酶 二硫苏糖醇 无核酸酶去离子水 乙酸钾 PCI 溶液 NT2 缓冲液 KNET 缓冲液
微离心管及加样器吸头 Sephadex G-50 柱
步骤
一、材料与设备
1. mRNA（购自 Clontech 公司，也可自行纯化获取）。
2. 工具酶：Superscript Ⅱ 反转录酶和缓冲液（Life Technologies 公司），E.coli RNase H（Life Technologies 公司），未端脱氧核糖核酸转移酶（Td Tase）和缓冲液（Life Technologies 公司），RNasin RNase 抑制剂（Promega 公司），Taq 酶。
3. 合成寡核苷酸（这里仅给出个例子）：
正向引物 [ oligo-dG ]：5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'
反向引物 [ oligo-dT ]：5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'
dNTP 混合物：10 mmol/L（dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均为 10 mmol/L）。
NTP 混合物：10 mmol/L（ATP、CTP、GTP、UTP 均为 10 mmol/L）。
4. 0.1 mol/L 二硫苏糖醇。
5. 无核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微离心管及加样器吸头。
6. 无核酸酶去离子水。
7. Sephadex G-50 柱。
8. 蛋白 A-sepharose 凝胶珠（P3391，Sigma 公司）。
9. 3 mol/L 乙酸钾（pH 5.2 )，100% 和 70% 乙醇，7.5 mol/L 乙酸铵，0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0），3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）。
10. PCI 溶液：酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1，体积比），用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。
11. NT2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4 )，150 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，1 mmol/L MgCl2。
12. KNET 缓冲液：20 mmol/L KCl，80 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，0.05% NP-40，5 mg/ml mRNA，1 mmol/L MgCl2，2.5% 聚乙烯醇，0.2% 核苷氧钒复合物（vanadyl ribonucleoside complex，VCR），0.1 mg/ml 牛血清白蛋白，0.5 mg/ml 酵母 tRNA，10 mmoI/L DTT，80 U/ml RNasin。临用前配制。
二、操作方法
实验分 5 步进行：首先，用 oligo-dT 引物对 mRNA 进行反转录；然后在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾；进而进行 PCR 扩增反应，在与 C-尾配对的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶启动子序列；扩增获得的 cDNA 再反转录合成 RNA；最后用靶蛋白质进行 RNA 文库的筛选工作。
1. 反转录 mRNA 合成 cDNA
(1) 在 13 μl 预处理的水中加入 1~5 μg mRNA，1 μl（0.5 μg）oligo-dT 引物，轻轻混匀。
(2) 反应管于 70℃ 反应 10 min，冰上放置 1 min，瞬时离心，加入 2 μl 10X 反转录酶缓冲液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反转录酶（200 U/μl），总体积 20 μl。
(3) 轻轻混匀后离心反应管，室温放置 10 min。
(4) 将反应管于 42°C 反应 50 min。70℃ 孵育 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。
(5) 离心收集产物，加 1 μl E.coli RNase H（2 U/μl），37℃ 孵育 20 min。
(6) 将反转录产物通过 Sephadex G-50 柱去除残余未反应的核苷酸。
(7) 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钾，乙醇沉淀单链 DNA。
2. 在 cDNA 库末端加 C-同聚尾
(1) 用水重悬 cDNA（3' 末端浓度约为 40 pmol/ml）。
(2) 在 1.5 ml 离心管内进行末端脱氧核糖核酸转移反应：10 μl 5X TdT 缓冲液，25 μl 100 μmol/L dCTP，cDNA，48.5 μl 水，1.5 μl (15U) TdTase；37℃ 反应 30 min。
(3) 将反应管置冰上，加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 终止反应。
(4) 加 60 μl PCI，充分混匀，15000 g 室温离心 5 min。
(5) 取上层水相，通过 Sephadex G-50 柱去除未反应的 dCTP。
(6) 0.5 倍体积 7.5 mol/L 乙酸铵，2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。
(7) 14000 g 室温离心 30 min，小心去除上清。
(8) 50 μl 水重悬 cDNA，20℃ 保存。
3. PCR 扩增 cDNA 库
(1) 反应混合液：41.5 μl 水，10 μl 10X PCR 缓冲液，2 μl dNTP 混合液，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA，0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反应条件：94°C，1 min；50℃，1 min；72℃，2 min；25 个循环，然后 72℃，7 min。
(2) 1 μl 20U/μl Bam HI （或其他在引物设计时引入的内切酶，以去除 PCR 过程中可能产生的多聚体），37℃ 反应 1 h。
(3) PCI 抽提，0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠、2.5 倍体积无水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。
(4) 12000 g 4℃ 离心 10 min，小心去除上清。
(5) 70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 15 μl 水重悬核酸。
(6) 1% 琼脂瑭凝胶电泳，切取 200~800 bp 的 DNA 片断。
(7) 纯化经过凝胶回收的 DNA，PCI 抽提，2.5 倍体积无水乙醇沉淀（冰浴 10 min )。12000 g 4°C 离心 15 min，小心去除上清。70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重悬核酸。
4. cDNA 库转录获得 3' UTR 文库
(1) 反应混合液：0.1 μg PCR 扩增得到的 cDNA 库，4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶缓冲液，8 μl NTP，1 μl 40 U/μl RNasin，1 μl T7 RNA 聚合酶，加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反应 10 min。
(2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗盐。将获得的 RNA 样品重悬于 20 μl DEPC-H2O。
(3) 取 2 μl 3% 琼脂糖凝胶电泳观察。
5. 用蛋白对 3' UTR 文库进行筛选
(1) 蛋白对 3' UTR 文库的结合
① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝胶珠，在 1.5 ml 离心管内用 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
② 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 2 μl 抗血淸。
③ 4°C 混匀至少 10 min。
④ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
⑤ 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 5 μl 0.5 μg/ml 纯化蛋白，4℃ 混匀至少 10 min。
⑥ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 缓冲液重悬蛋白 A-sephrose 凝胶珠/抗血清/蛋白。
⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。
⑨ 室温混匀 5 min。
⑩ 1 ml NT2 缓冲液洗 5 次。
⑾ 最一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 100 μl 水。
⑿ 200 μl PCI 抽提。
⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2（或 10 mmol/L tRNA )，20 μl 3 mol/L 乙酸钠，700 μl 无水乙醇沉淀。
⒁ 70% 乙醇洗盐，室温干燥。
⒂ 14 μl DEPC-H2O 重悬。
(2) 反转录筛选获得 3'-UTR
① 在 14 μl DEPC-H2O 重悬的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，10X 反转录缓冲液，1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl Superscript II 及转录酶（200 U/μl )。室温孵育 5 min，42℃ 反应 50 min。
② 72℃ 反应 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。
③ 将反应管离心，加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H，37°C 反应 20 min。
④ 将反应产物过 Sephadex G-50 柱两次，彻底去除未反应的核苷酸。
⑤ 取 6 μl cDNA 产物进行 PCR 扩增（重复 PCR，反转录和筛选试验直至获得最终结果）。
如果采用高严谨性的筛选方法，可以只进行一次结合筛选操作。高严谨性的结合筛选条件包括提高盐浓度（可高至 350 mmol/L），增加漂洗缓冲液中尿素的浓度（0.5~4 mol/L)。使用高严谨性条件进行一次结合筛选的优点除了省时省力之外，最重要的是可以降低由于 PCR 引入的错误。
可以在进行转录时加入同位素标记，比较同样量筛选获得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 库能够被蛋白沉淀的同位素活性，判断是否筛选得到了特异性的蛋白结合 RNA。筛选得到的克隆可以通过 PCR 扩增时引入的限制酶位点克隆到 PGEM 或 pSP64 质粒中。挑单克隆抽提质粒，测序，进行 BLAST 分析。
这里介绍的是从大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 库中筛选 RNA 结合蛋白的作用靶的方法。一定要注意将筛选得到的结果与生物学功能相联系。如果某蛋白与一已知靶 RNA 的 RNA 结合蛋白高度同源，可以考虑直接检测此蛋白是否也具有结合同一靶 RNA 的能力。如果从随机 RNA 文库中筛选得到一定的位点规律，也可以应用于按照规律寻找已知蛋白的其他靶标 RNA。在体外实验确证蛋白与 RNA 间的相互作用后还需要用体内方法（梯度离心，免疫共沉淀结合 Northern 杂交，RT-PCR，RNase 保护法等）进行进一步确认。
1. mRNA（购自 Clontech 公司，也可自行纯化获取）。
2. 工具酶：Superscript Ⅱ 反转录酶和缓冲液（Life Technologies 公司），E.coli RNase H（Life Technologies 公司），未端脱氧核糖核酸转移酶（Td Tase）和缓冲液（Life Technologies 公司），RNasin RNase 抑制剂（Promega 公司），Taq 酶。
3. 合成寡核苷酸（这里仅给出个例子）：
正向引物 [ oligo-dG ]：5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'
反向引物 [ oligo-dT ]：5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'
dNTP 混合物：10 mmol/L（dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均为 10 mmol/L）。
NTP 混合物：10 mmol/L（ATP、CTP、GTP、UTP 均为 10 mmol/L）。
4. 0.1 mol/L 二硫苏糖醇。
5. 无核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微离心管及加样器吸头。
6. 无核酸酶去离子水。
7. Sephadex G-50 柱。
8. 蛋白 A-sepharose 凝胶珠（P3391，Sigma 公司）。
9. 3 mol/L 乙酸钾（pH 5.2 )，100% 和 70% 乙醇，7.5 mol/L 乙酸铵，0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0），3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）。
10. PCI 溶液：酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1，体积比），用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。
11. NT2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4 )，150 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，1 mmol/L MgCl2。
12. KNET 缓冲液：20 mmol/L KCl，80 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，0.05% NP-40，5 mg/ml mRNA，1 mmol/L MgCl2，2.5% 聚乙烯醇，0.2% 核苷氧钒复合物（vanadyl ribonucleoside complex，VCR），0.1 mg/ml 牛血清白蛋白，0.5 mg/ml 酵母 tRNA，10 mmoI/L DTT，80 U/ml RNasin。临用前配制。
二、操作方法
实验分 5 步进行：首先，用 oligo-dT 引物对 mRNA 进行反转录；然后在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾；进而进行 PCR 扩增反应，在与 C-尾配对的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶启动子序列；扩增获得的 cDNA 再反转录合成 RNA；最后用靶蛋白质进行 RNA 文库的筛选工作。
1. 反转录 mRNA 合成 cDNA
(1) 在 13 μl 预处理的水中加入 1~5 μg mRNA，1 μl（0.5 μg）oligo-dT 引物，轻轻混匀。
(2) 反应管于 70℃ 反应 10 min，冰上放置 1 min，瞬时离心，加入 2 μl 10X 反转录酶缓冲液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反转录酶（200 U/μl），总体积 20 μl。
(3) 轻轻混匀后离心反应管，室温放置 10 min。
(4) 将反应管于 42°C 反应 50 min。70℃ 孵育 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。
(5) 离心收集产物，加 1 μl E.coli RNase H（2 U/μl），37℃ 孵育 20 min。
(6) 将反转录产物通过 Sephadex G-50 柱去除残余未反应的核苷酸。
(7) 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钾，乙醇沉淀单链 DNA。
2. 在 cDNA 库末端加 C-同聚尾
(1) 用水重悬 cDNA（3' 末端浓度约为 40 pmol/ml）。
(2) 在 1.5 ml 离心管内进行末端脱氧核糖核酸转移反应：10 μl 5X TdT 缓冲液，25 μl 100 μmol/L dCTP，cDNA，48.5 μl 水，1.5 μl (15U) TdTase；37℃ 反应 30 min。
(3) 将反应管置冰上，加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 终止反应。
(4) 加 60 μl PCI，充分混匀，15000 g 室温离心 5 min。
(5) 取上层水相，通过 Sephadex G-50 柱去除未反应的 dCTP。
(6) 0.5 倍体积 7.5 mol/L 乙酸铵，2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。
(7) 14000 g 室温离心 30 min，小心去除上清。
(8) 50 μl 水重悬 cDNA，20℃ 保存。
3. PCR 扩增 cDNA 库
(1) 反应混合液：41.5 μl 水，10 μl 10X PCR 缓冲液，2 μl dNTP 混合液，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA，0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反应条件：94°C，1 min；50℃，1 min；72℃，2 min；25 个循环，然后 72℃，7 min。
(2) 1 μl 20U/μl Bam HI （或其他在引物设计时引入的内切酶，以去除 PCR 过程中可能产生的多聚体），37℃ 反应 1 h。
(3) PCI 抽提，0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠、2.5 倍体积无水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。
(4) 12000 g 4℃ 离心 10 min，小心去除上清。
(5) 70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 15 μl 水重悬核酸。
(6) 1% 琼脂瑭凝胶电泳，切取 200~800 bp 的 DNA 片断。
(7) 纯化经过凝胶回收的 DNA，PCI 抽提，2.5 倍体积无水乙醇沉淀（冰浴 10 min )。12000 g 4°C 离心 15 min，小心去除上清。70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重悬核酸。
4. cDNA 库转录获得 3' UTR 文库
(1) 反应混合液：0.1 μg PCR 扩增得到的 cDNA 库，4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶缓冲液，8 μl NTP，1 μl 40 U/μl RNasin，1 μl T7 RNA 聚合酶，加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反应 10 min。
(2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗盐。将获得的 RNA 样品重悬于 20 μl DEPC-H2O。
(3) 取 2 μl 3% 琼脂糖凝胶电泳观察。
5. 用蛋白对 3' UTR 文库进行筛选
(1) 蛋白对 3' UTR 文库的结合
① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝胶珠，在 1.5 ml 离心管内用 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
② 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 2 μl 抗血淸。
③ 4°C 混匀至少 10 min。
④ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
⑤ 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 5 μl 0.5 μg/ml 纯化蛋白，4℃ 混匀至少 10 min。
⑥ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。
⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 缓冲液重悬蛋白 A-sephrose 凝胶珠/抗血清/蛋白。
⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。
⑨ 室温混匀 5 min。
⑩ 1 ml NT2 缓冲液洗 5 次。
⑾ 最一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 100 μl 水。
⑿ 200 μl PCI 抽提。
⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2（或 10 mmol/L tRNA )，20 μl 3 mol/L 乙酸钠，700 μl 无水乙醇沉淀。
⒁ 70% 乙醇洗盐，室温干燥。
⒂ 14 μl DEPC-H2O 重悬。
(2) 反转录筛选获得 3'-UTR
① 在 14 μl DEPC-H2O 重悬的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，10X 反转录缓冲液，1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl Superscript II 及转录酶（200 U/μl )。室温孵育 5 min，42℃ 反应 50 min。
② 72℃ 反应 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。
③ 将反应管离心，加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H，37°C 反应 20 min。
④ 将反应产物过 Sephadex G-50 柱两次，彻底去除未反应的核苷酸。
⑤ 取 6 μl cDNA 产物进行 PCR 扩增（重复 PCR，反转录和筛选试验直至获得最终结果）。
如果采用高严谨性的筛选方法，可以只进行一次结合筛选操作。高严谨性的结合筛选条件包括提高盐浓度（可高至 350 mmol/L），增加漂洗缓冲液中尿素的浓度（0.5~4 mol/L)。使用高严谨性条件进行一次结合筛选的优点除了省时省力之外，最重要的是可以降低由于 PCR 引入的错误。
可以在进行转录时加入同位素标记，比较同样量筛选获得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 库能够被蛋白沉淀的同位素活性，判断是否筛选得到了特异性的蛋白结合 RNA。筛选得到的克隆可以通过 PCR 扩增时引入的限制酶位点克隆到 PGEM 或 pSP64 质粒中。挑单克隆抽提质粒，测序，进行 BLAST 分析。
这里介绍的是从大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 库中筛选 RNA 结合蛋白的作用靶的方法。一定要注意将筛选得到的结果与生物学功能相联系。如果某蛋白与一已知靶 RNA 的 RNA 结合蛋白高度同源，可以考虑直接检测此蛋白是否也具有结合同一靶 RNA 的能力。如果从随机 RNA 文库中筛选得到一定的位点规律，也可以应用于按照规律寻找已知蛋白的其他靶标 RNA。在体外实验确证蛋白与 RNA 间的相互作用后还需要用体内方法（梯度离心，免疫共沉淀结合 Northern 杂交，RT-PCR，RNase 保护法等）进行进一步确认。
相关文章
