天然RNA文库筛选与蛋白特异性结合的RNA序列实验

细胞中，蛋白质与 RNA 结合参与多种生理调控和发育过程。在 mRNA 的加帽，多聚腺苷酸化，剪切，核外运，翻译起始及降解等过程中都存在着蛋白质与 RNA 的直接相互作用。在发育的各个阶段，RNA 结合蛋白可以通过与 mRNA 的相互作用调控基因的表达。

mRNA 寡核苷酸
工具酶 二硫苏糖醇 无核酸酶去离子水 乙酸钾 PCI 溶液 NT2 缓冲液 KNET 缓冲液
微离心管及加样器吸头 Sephadex G-50 柱

一、材料与设备

1. mRNA（购自 Clontech 公司，也可自行纯化获取）。

2. 工具酶：Superscript Ⅱ 反转录酶和缓冲液（Life Technologies 公司），E.coli RNase H（Life Technologies 公司），未端脱氧核糖核酸转移酶（Td Tase）和缓冲液（Life Technologies 公司），RNasin RNase 抑制剂（Promega 公司），Taq 酶。

3. 合成寡核苷酸（这里仅给出个例子）：

正向引物 [ oligo-dG ]：5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'

反向引物 [ oligo-dT ]：5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'

dNTP 混合物：10 mmol/L（dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均为 10 mmol/L）。

NTP 混合物：10 mmol/L（ATP、CTP、GTP、UTP 均为 10 mmol/L）。

4. 0.1 mol/L 二硫苏糖醇。

5. 无核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微离心管及加样器吸头。

6. 无核酸酶去离子水。

7. Sephadex G-50 柱。

8. 蛋白 A-sepharose 凝胶珠（P3391，Sigma 公司）。

9. 3 mol/L 乙酸钾（pH 5.2 )，100% 和 70% 乙醇，7.5 mol/L 乙酸铵，0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0），3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2）。

10. PCI 溶液：酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1，体积比），用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。

11. NT2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4 )，150 mmol/L NaCl，0.05% NP-40，1 mmol/L MgCl2。

12. KNET 缓冲液：20 mmol/L KCl，80 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，0.05% NP-40，5 mg/ml mRNA，1 mmol/L MgCl2，2.5% 聚乙烯醇，0.2% 核苷氧钒复合物（vanadyl ribonucleoside complex，VCR），0.1 mg/ml 牛血清白蛋白，0.5 mg/ml 酵母 tRNA，10 mmoI/L DTT，80 U/ml RNasin。临用前配制。



二、操作方法

实验分 5 步进行：首先，用 oligo-dT 引物对 mRNA 进行反转录；然后在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾；进而进行 PCR 扩增反应，在与 C-尾配对的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶启动子序列；扩增获得的 cDNA 再反转录合成 RNA；最后用靶蛋白质进行 RNA 文库的筛选工作。

1. 反转录 mRNA 合成 cDNA

(1) 在 13 μl 预处理的水中加入 1~5 μg mRNA，1 μl（0.5 μg）oligo-dT 引物，轻轻混匀。

(2) 反应管于 70℃ 反应 10 min，冰上放置 1 min，瞬时离心，加入 2 μl 10X 反转录酶缓冲液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反转录酶（200 U/μl），总体积 20 μl。

(3) 轻轻混匀后离心反应管，室温放置 10 min。

(4) 将反应管于 42°C 反应 50 min。70℃ 孵育 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。

(5) 离心收集产物，加 1 μl E.coli RNase H（2 U/μl），37℃ 孵育 20 min。

(6) 将反转录产物通过 Sephadex G-50 柱去除残余未反应的核苷酸。

(7) 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钾，乙醇沉淀单链 DNA。

2. 在 cDNA 库末端加 C-同聚尾

(1) 用水重悬 cDNA（3' 末端浓度约为 40 pmol/ml）。

(2) 在 1.5 ml 离心管内进行末端脱氧核糖核酸转移反应：10 μl 5X TdT 缓冲液，25 μl 100 μmol/L dCTP，cDNA，48.5 μl 水，1.5 μl (15U) TdTase；37℃ 反应 30 min。

(3) 将反应管置冰上，加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 终止反应。

(4) 加 60 μl PCI，充分混匀，15000 g 室温离心 5 min。

(5) 取上层水相，通过 Sephadex G-50 柱去除未反应的 dCTP。

(6) 0.5 倍体积 7.5 mol/L 乙酸铵，2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。

(7) 14000 g 室温离心 30 min，小心去除上清。

(8) 50 μl 水重悬 cDNA，20℃ 保存。

3. PCR 扩增 cDNA 库

(1) 反应混合液：41.5 μl 水，10 μl 10X PCR 缓冲液，2 μl dNTP 混合液，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物，1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA，0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反应条件：94°C，1 min；50℃，1 min；72℃，2 min；25 个循环，然后 72℃，7 min。

(2) 1 μl 20U/μl Bam HI （或其他在引物设计时引入的内切酶，以去除 PCR 过程中可能产生的多聚体），37℃ 反应 1 h。

(3) PCI 抽提，0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠、2.5 倍体积无水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。

(4) 12000 g 4℃ 离心 10 min，小心去除上清。

(5) 70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 15 μl 水重悬核酸。

(6) 1% 琼脂瑭凝胶电泳，切取 200~800 bp 的 DNA 片断。

(7) 纯化经过凝胶回收的 DNA，PCI 抽提，2.5 倍体积无水乙醇沉淀（冰浴 10 min )。12000 g 4°C 离心 15 min，小心去除上清。70% 乙醇洗盐，离心去上清，干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重悬核酸。

4. cDNA 库转录获得 3' UTR 文库

(1) 反应混合液：0.1 μg PCR 扩增得到的 cDNA 库，4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶缓冲液，8 μl NTP，1 μl 40 U/μl RNasin，1 μl T7 RNA 聚合酶，加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反应 10 min。

(2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗盐。将获得的 RNA 样品重悬于 20 μl DEPC-H2O。

(3) 取 2 μl 3% 琼脂糖凝胶电泳观察。

5. 用蛋白对 3' UTR 文库进行筛选

(1) 蛋白对 3' UTR 文库的结合

① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝胶珠，在 1.5 ml 离心管内用 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

② 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 2 μl 抗血淸。

③ 4°C 混匀至少 10 min。

④ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

⑤ 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 5 μl 0.5 μg/ml 纯化蛋白，4℃ 混匀至少 10 min。

⑥ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 缓冲液重悬蛋白 A-sephrose 凝胶珠/抗血清/蛋白。

⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。

⑨ 室温混匀 5 min。

⑩ 1 ml NT2 缓冲液洗 5 次。

⑾ 最一次洗后留 100 μl 缓冲液，加入 100 μl 水。

⑿ 200 μl PCI 抽提。

⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2（或 10 mmol/L tRNA )，20 μl 3 mol/L 乙酸钠，700 μl 无水乙醇沉淀。

⒁ 70% 乙醇洗盐，室温干燥。

⒂ 14 μl DEPC-H2O 重悬。

(2) 反转录筛选获得 3'-UTR

① 在 14 μl DEPC-H2O 重悬的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物，10X 反转录缓冲液，1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl Superscript II 及转录酶（200 U/μl )。室温孵育 5 min，42℃ 反应 50 min。

② 72℃ 反应 15 min 终止反应，将反应管转移至冰上。

③ 将反应管离心，加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H，37°C 反应 20 min。

④ 将反应产物过 Sephadex G-50 柱两次，彻底去除未反应的核苷酸。

⑤ 取 6 μl cDNA 产物进行 PCR 扩增（重复 PCR，反转录和筛选试验直至获得最终结果）。

如果采用高严谨性的筛选方法，可以只进行一次结合筛选操作。高严谨性的结合筛选条件包括提高盐浓度（可高至 350 mmol/L），增加漂洗缓冲液中尿素的浓度（0.5~4 mol/L)。使用高严谨性条件进行一次结合筛选的优点除了省时省力之外，最重要的是可以降低由于 PCR 引入的错误。

可以在进行转录时加入同位素标记，比较同样量筛选获得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 库能够被蛋白沉淀的同位素活性，判断是否筛选得到了特异性的蛋白结合 RNA。筛选得到的克隆可以通过 PCR 扩增时引入的限制酶位点克隆到 PGEM 或 pSP64 质粒中。挑单克隆抽提质粒，测序，进行 BLAST 分析。

这里介绍的是从大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 库中筛选 RNA 结合蛋白的作用靶的方法。一定要注意将筛选得到的结果与生物学功能相联系。如果某蛋白与一已知靶 RNA 的 RNA 结合蛋白高度同源，可以考虑直接检测此蛋白是否也具有结合同一靶 RNA 的能力。如果从随机 RNA 文库中筛选得到一定的位点规律，也可以应用于按照规律寻找已知蛋白的其他靶标 RNA。在体外实验确证蛋白与 RNA 间的相互作用后还需要用体内方法（梯度离心，免疫共沉淀结合 Northern 杂交，RT-PCR，RNase 保护法等）进行进一步确认。