反义RNA的制备实验
材料与仪器限制性内切核酸酶酶水解 模板 DNA 大肠杆菌 DNA 多聚酶 胰 DNaseⅠ氯仿 苯酚 乙醇 DTTrNTP溶液 转录缓冲液 Tris-Cl 盐酸
材料与仪器
限制性内切核酸酶酶水解 模板 DNA 大肠杆菌 DNA 多聚酶 胰 DNaseⅠ
氯仿 苯酚 乙醇 DTTrNTP溶液 转录缓冲液 Tris-Cl 盐酸亚精胺 NaCl 胎盘RNase抑制物 牛血清白蛋白 RNA聚合酶 DEPC
DNA合成仪 琼脂糖凝胶电泳 微量离心管
氯仿 苯酚 乙醇 DTTrNTP溶液 转录缓冲液 Tris-Cl 盐酸亚精胺 NaCl 胎盘RNase抑制物 牛血清白蛋白 RNA聚合酶 DEPC
DNA合成仪 琼脂糖凝胶电泳 微量离心管
步骤
一、化学合成的 RNA
RNA 也可以用来检测目标基因的功能性结构域或用来调节基因表达。反义 RNA 与目标基因的特定结构域互补，能有效地形成稳定的 目标 RNA-反义 RNA 杂交体。
1. RNA 可用自动 DNA 合成仪合成，如 Applied Biosystem 的 DNA 合成仪。
2. 通常用 2'-OMe ( 甲氧基）RNA 和 2'-OMe 次黄嘌呤而不是用 2'-OMe 鸟嘌呤与胞嘧啶配对。
二、从载体/cDNA 克隆转录制备反义 RNA
RNA 也可以由线状 DNA 为模板，通过 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6 ) 在体外合成。
1. 将一段 DNA 序列插入载体的多克隆位点，这类载体在多克隆位点附近带有噬菌体 RNA 聚合酶转录识别序列，即带有 T3、T7 或 SP6 启动子 ( 载体上克隆的 DNA 序列与目标基因相同，而其转录产物则是由载体上的启动子从 3' 端开始转录产生的，因此转录产物 RNA 可与目标基因互补。
2. 用适当的限制性内切核酸酶酶水解，制备 2 pmol/L 的模板 DNA ( 1 pmol/L 3 kb 的质粒约为 2 μg )，并取一部分水解后的 DNA（约需 100 ng）进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3. DNA 3' 末端的突出端可以用大肠杆菌 DNA 多聚酶的 Klenow 片段或噬菌体 T4 DNA 聚合酶在 4 种 dNTP 存在的条件下将其除去。
4. 用氯仿：苯酚纯化模板 DNA，然后用乙醇沉淀。随后把 DNA 溶于 TE ( pH 7.0 )，浓度约为 250~500 nmol/L。
5. 室温下，在微量离心管中依次混合下列组分：DNA 模板 0.2 pmol，DTT (1 mol/L) 0.1 μl，rNTP 溶液（各 5 mmol/L） 1.0 μl， 10X 转录缓冲液 1.0 μl，400 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5 37℃)，60 mmol/L MgCI2，20 mmol/L 盐酸亚精胺，50 mmol/L NaCl，胎盘 RNase 抑制物（10U ) 0.5 μl，牛血清白蛋白（2 mg/ml ) 0.5 μl，噬菌体 DNA 依赖的 RNA 聚合酶（10U ) 1.0 μl，用 DEPC 水补齐至 10 μl，以上缓冲液均应消毒并分管保存在 -20°C。
混匀各成分时要并避免气泡产生。将反应液置于 37℃ 1~2 h ( T3 或 T7 RNA 聚合酶）或 40°C 1~2 h( SP6 RNA 多聚酶）。
6. 加入 1 μl 无 RNase 的胰 DNase Ⅰ(1 U/μl )，混匀，37℃ 反应 15 min。
7. 加入 100 μl 无 RNase 的水，用 1：1 的苯酚：氯仿纯化RNA。
8. 将水相转移至另一个离心管中，加入 20 μl 5 mol/L 的乙酸铵，混匀后再加入 250 μl 冰预冷的乙醇，-20℃ 静置 60 min，12000 g 4°C 离心 20 min，收集 RNA。
9. 弃去乙醇，并使残留的乙醇挥发干净，将 RNA 沉淀溶于 100 μl 无 RNase 的水中。 加入 2 倍体积的冰预冷乙醇，混匀后分管 -70℃ 存放。在使用前，取出分装管加入 0.1 体积的 5 mol/L 乙酸铵，混匀后置于 -20℃ 15 min 以上， 4°C 12000 g 离心沉淀，去净乙醇，将 RNA 溶于适当体积的无 RNase 的相应缓冲液中。
RNA 也可以用来检测目标基因的功能性结构域或用来调节基因表达。反义 RNA 与目标基因的特定结构域互补，能有效地形成稳定的 目标 RNA-反义 RNA 杂交体。
1. RNA 可用自动 DNA 合成仪合成，如 Applied Biosystem 的 DNA 合成仪。
2. 通常用 2'-OMe ( 甲氧基）RNA 和 2'-OMe 次黄嘌呤而不是用 2'-OMe 鸟嘌呤与胞嘧啶配对。
二、从载体/cDNA 克隆转录制备反义 RNA
RNA 也可以由线状 DNA 为模板，通过 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6 ) 在体外合成。
1. 将一段 DNA 序列插入载体的多克隆位点，这类载体在多克隆位点附近带有噬菌体 RNA 聚合酶转录识别序列，即带有 T3、T7 或 SP6 启动子 ( 载体上克隆的 DNA 序列与目标基因相同，而其转录产物则是由载体上的启动子从 3' 端开始转录产生的，因此转录产物 RNA 可与目标基因互补。
2. 用适当的限制性内切核酸酶酶水解，制备 2 pmol/L 的模板 DNA ( 1 pmol/L 3 kb 的质粒约为 2 μg )，并取一部分水解后的 DNA（约需 100 ng）进行琼脂糖凝胶电泳分析。
3. DNA 3' 末端的突出端可以用大肠杆菌 DNA 多聚酶的 Klenow 片段或噬菌体 T4 DNA 聚合酶在 4 种 dNTP 存在的条件下将其除去。
4. 用氯仿：苯酚纯化模板 DNA，然后用乙醇沉淀。随后把 DNA 溶于 TE ( pH 7.0 )，浓度约为 250~500 nmol/L。
5. 室温下，在微量离心管中依次混合下列组分：DNA 模板 0.2 pmol，DTT (1 mol/L) 0.1 μl，rNTP 溶液（各 5 mmol/L） 1.0 μl， 10X 转录缓冲液 1.0 μl，400 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5 37℃)，60 mmol/L MgCI2，20 mmol/L 盐酸亚精胺，50 mmol/L NaCl，胎盘 RNase 抑制物（10U ) 0.5 μl，牛血清白蛋白（2 mg/ml ) 0.5 μl，噬菌体 DNA 依赖的 RNA 聚合酶（10U ) 1.0 μl，用 DEPC 水补齐至 10 μl，以上缓冲液均应消毒并分管保存在 -20°C。
混匀各成分时要并避免气泡产生。将反应液置于 37℃ 1~2 h ( T3 或 T7 RNA 聚合酶）或 40°C 1~2 h( SP6 RNA 多聚酶）。
6. 加入 1 μl 无 RNase 的胰 DNase Ⅰ(1 U/μl )，混匀，37℃ 反应 15 min。
7. 加入 100 μl 无 RNase 的水，用 1：1 的苯酚：氯仿纯化RNA。
8. 将水相转移至另一个离心管中，加入 20 μl 5 mol/L 的乙酸铵，混匀后再加入 250 μl 冰预冷的乙醇，-20℃ 静置 60 min，12000 g 4°C 离心 20 min，收集 RNA。
9. 弃去乙醇，并使残留的乙醇挥发干净，将 RNA 沉淀溶于 100 μl 无 RNase 的水中。 加入 2 倍体积的冰预冷乙醇，混匀后分管 -70℃ 存放。在使用前，取出分装管加入 0.1 体积的 5 mol/L 乙酸铵，混匀后置于 -20℃ 15 min 以上， 4°C 12000 g 离心沉淀，去净乙醇，将 RNA 溶于适当体积的无 RNase 的相应缓冲液中。
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