RNase A/Tl 保护和 RNase H 聚焦法实验（RNase保护法）

RNA与互补的 [ 32P ] 标记的探针在溶液中复件后形成的 RNA-RNA 杂合分子对单链专一的 RNase 具有抗性。此法可以对 RNA 分子末端进行定位或对含内含子的交界定位。与 Northern blot 相比，它是一种十分有效而且灵敏度很高的并可用于测定 mRNA 丰度的方法。杂交过程中加入过量的探针能使所有互补序列形成标记的杂合分子。未杂交探引和已杂交探针的单链部分则被消化而清除。“被保护的”探针通过变性的聚丙烯酰胺凝胶来检测并定量。最初是用 DNA 单链作为探针，但是单链 DNA 的制备耗时多。又因为标记 RNA非常容易，所以根据 RNA-RNA 杂交进行测定十分有利。

胰RNase RNase T1 蛋白酶K
杂交混合液 RNase消化缓冲液
水浴 垂直电泳装置 暗片盒 X射线片 探针

一、材料与设备

1. 水浴。

2. 垂直电泳装置。

3. 暗片盒。

4. X 射线片。

5. [ 32P ] 标记的探针：将探针溶于水中，浓度为 1~2 ng/μl。

6. 杂交混合液：80% 去离子甲酰胺，0.4 mol/L NaCl，40 mmol/L NaPIPESC（pH 6.8 )， 1 mmol/L EDTA。

7. RNase 消化缓冲液：300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，4 mmol/L EDTA。

8. 胰 RNase：将酶溶于含 10 mmol/L NaCl 的 TE 溶液中，浓度为 10 mg/ml，煮沸 15 min，缓慢冷却到室温。溶液分装小份于 -20℃ 储存。

9. RNase T1：溶于 TE 中，浓度为 1 mg/ml，调 pH 至 7.0，溶液分装小份于 -20°C 储存。

10. 蛋白酶K：将酶溶于水，浓度为 20 mg/ml，分装小份于 -20℃ 储存。

二、操作方法

1. 对每份样品，加 1 μl 探针于 29 μl 杂交混合液中。探针重溶于水，为最终体积的 3%，探针的实际数最并不严格，因为探针对特定的目标片段而言是过量的。

2. 将冻干或乙醇沉淀的 10 μg RNA 样品重悬于 30 μl 完全的杂交液（含探针）。90℃ 加热 2 min，然后于 45°C 保温过夜。

3. 将样品置冰上冷却，加 300 μl RNase 消化缓冲液。可用胰 RNase 或 RNase T1 或 两酶共同于 25℃ 消化 1 h。用胰 RNase 切割尿嘧啶或胞嘧啶后面的残基，RNaseT1 切割鸟嘌呤后面的残基。

4. 加 20 μl 10% SDS，用 0.5 μl ( 10 μg ）蛋白酶 K 于 37℃ 消化 10~20 min，除去 RNase，用酚：氯仿抽提两次。加 10 μg 载体 tRNA 后，用乙醇沉淀 RNA。

5. 重悬 RNA 于样品缓冲液中，90℃ 加热 2 min 使杂种分子变性。在适当浓度的聚丙烯酰胺-尿素测序胶上电泳，用 20% 乙醇将胶固定，用 10% 乙酸除去尿素后作放射自显影。