核酸（基因）探针目的核酸的制备技术

第二节　核酸（基因）探针目的核酸的制备技术

一、特异性目的核酸（或基因）的制备

核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备：

　　（1）直接分离基因核酸：即从 基因组 上直接用内切酶切下所需基因。

（2）化学合成基因核酸：即以单核苷酸为原料，以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚，分子量较小的寡核苷核。

（3）酶促合成核酸：在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以mRNA为模板，利用逆转录酶合成单链cDNA，再以大肠杆菌DNA聚合酶I合成双链的结构基因。

（4）RNA探针。

二、目的核酸的扩增

　　在获得特异的目的基因后，可用以下方法大量扩增制备：①用体外DNA重组技术与 载体 DNA相连，转化至大肠杆菌中进行无性繁殖。以氯化铯超速离心纯化重组质粒DNA，并以合适限制性内切酶消化，经凝胶电泳制备回收特异的目的核酸片段。②聚合酶链式反应（Poly－merase chain reaction, PCR）扩增技术：利用这种先进技术能简便快速制备大量特异性目的核酸片段。PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特征，在体外用一对和欲扩增DNA片段的两侧序列互补的引物诱发聚合反应，即双链DNA先高温变性，然后在低温下与引物退火，再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应，重复这种循环反应可使DNA获得指数性倍增，例如经过35个循环反应，DNA可扩增1×10 8 倍以上。