DNA序列分析技术

物种的遗传多样性在本质上是DNA 一级序列的多样性。近年来，随着DNA 测序技术的迅速发展和日益普及，DNA 测序在遗传多样性的研究中正在起着越来越大的作用。本章将介绍目前在遗传多样性研究中常用的一种手动和一种全自动双链DNA 测序方法。

1 DNA 模板的制备

在遗传多样性的研究中，由于样本量一般都较庞大，因而DNA 测序的速度就成了很关键的因素。因此，这类研究中常常直接测定纯化的PCR 双链产物而不大采用克隆技术。本节介绍本实验室常用的从PCR 产物制备测序模板的方法，即低熔点胶回收法。

（1）制备1.5％～2.0％的琼脂糖凝胶，待其充分凝固后，在离点样线5cm 左右处切下宽约1cm 的胶条，在切出的槽中倒入预先煮沸的低熔点琼脂糖胶。

（2）低熔点胶凝固后，将待纯化的PCR 反应液全部点样，恒压100V 左右进行电泳，直至扩增片段进入到低熔点胶中部。在360nm 紫外光下，将已进入低熔点胶的条带切下，放入1．5ml离心管中。

（3）离心，将胶块压缩到管底，然后补加 TE 至 500μl。于 68℃水浴，将低熔点胶熔化，再迅速加入等体积的水饱和酚并混匀。

（4）室温下振荡抽提10 分钟，再12 000r／min 离心 10 分钟。取上清液再用氯仿-异戊醇（24:1）抽提5 分钟。

（5）12 000r／min 离心 10 分钟，取上清液，在其中加入 1／10 体积的 10 mol／dm3NH4Ac和2 倍体积的无水乙醇，置―70℃下沉淀半小时以上。

（6）再12 000r／min 离心 10 分钟，沉淀用 70％的冷乙醇洗涤；再次短暂离心后小心地倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入20～50μlTE 缓冲液或无菌去离子水中溶解，即为制好的DNA模板。

目前还有一些非常有效的商售试剂盒可用于纯化 PCR 产物，如 Oiagen PCR 产物纯化试剂盒等，但成本较高。

2 手动DNA 序列分析技术

2.1 测序胶的制备

按以下配方制备测序电泳胶： 6％胶工作液 70ml 10％过硫酸胺（APS） 70μl（新鲜配制） TEMED 70μl 将上述溶液混合后，灌入准备好的胶板中，将“鲨鱼齿”梳子反插入胶，深约0.5～1.0cm。室温下聚合1 小时左右

2.2 测序反应

测序试剂盒购自美国 USB 公司，测序酶为 Sequenase Version 2.0；α35S-dATP 购自美国

DuPont 公司（1mCui／100μl）。测序反应按USB 推荐的方法进行：

（1）DNA 模板混合液（0．5ml Eppendorf 管）：

DNA 模板 7μl 测序引物 1μl 5 倍 Reaction buffer 2μl NP4O 1μl

（2）标记混合液（每一反应的量）：

DTT（0.1mol／dm3） 1μl 1／5dGTP labelling mix 2μl Enzyme dilution buffer 1.75μl NP4O 0.55μl 去离子水 0.375μl 测序酶 0.125μl 35S-dATP 0.5μl

（3）ddNTP（ddA、ddG、ddC、ddT） 2.5μl

（4）退火反应（annealing）：将DNA 模板混合液煮沸3 分钟，迅速放入乙醇和干冰的混合冰浴箱中退火30 秒左右（如无干冰，则用冷冻于－20℃～－70℃下的无水乙醇，临用前由冰箱中取出）。在进行标记反应之前，反应液需保存于干冰或碎冰中。

（5）标记反应（labelling）：由干冰或冰中取出经退火的DNA 模板混合液，放在手中使其融化，然后加入 5.5μl 的标记混合液。在微型离心机上离心 10～15 秒后，置室温中 1 分钟。

（6）链终止反（termination）：将上一步骤制成的混合液以每管3.3μl 分装入预先在37℃下温浴的加有ddNTP 的管中，并在37℃下反应4～5 分钟。

（7）每管加入4μl 终止液（stop solution）。

2.3 电泳

电极缓冲液 1 倍TBE（pH 值8.0） 预电泳 30 分钟至1 小时 恒温方式 测序胶板上夹盖铝恒温板 电泳温度 50℃左右 电泳条件 恒功率 90～110W 电泳时间 2.5 小时至5 小时

2.4 干胶制备和压片

电泳结束后取下胶板，用工具撬开玻璃板，使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧，使胶粘在滤纸上，然后将胶放置于干胶器中制备干胶1～1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将X 光片压于胶上曝光2～3 天。

2.5 X 光片的冲洗

将曝光后的X 光片显影4～8 分钟（根据显影液的使用时间长短而定）；定影5～10 分钟，冲洗后即可读取DNA 序列。

3 自动 DNA 序列分析技术

本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。

3.1 混合反应物

（1）取2.5μl 纯化好的PCR 产物［相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，进行琼脂糖凝胶电泳。

（2）凝胶用溴化乙锭染色，用流水冲洗脱色后，在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf

（十）DNA 估测待测DNA 模板的浓度，以确定测序反应中应取的模板量。

（3）在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反应物：

DNA 模板 适量 引物（10pmol／ml） 0.5μl 加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit） 100℃下变性2 分钟，再冰浴2 分钟后短暂离心，然后加： DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl 或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl 终体积 10μl

（4）用微量取样器将反应物充分混合后，加 20μl 石蜡油覆盖。

3.2 热循环反应

该反应中降温时间非常关键（约1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪（PCR 仪，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中，按以下程序进行热循环反应：

（1）96℃ 1 秒钟 96℃ 30 秒钟

（2）50℃ 1 秒钟 50℃ 1 分钟

（3）60℃ l 秒钟 60℃ 4 分钟

共需25 个循环。

3.3 纯化测序产物

纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作过程如下：

（1）轻弹柱，使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。

（2）移去柱上盖，加入 800μl 去离子水，再盖上盖振荡，以除去气泡。

（3）在室温下放置30 分钟，以水化凝胶柱。

（4）移去柱上盖和下盖，将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中，让多余液体流出。

（5）倒去液体，将柱连同洗脱管一起在 3 000r／min 下离心 2 分钟。

（6）将柱放入一个1.5ml 离心管中，用微量取样器将测序反应物取出，注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。

（7）3 000r／min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。

（8）将样品放在真空干燥离心机中干燥。

（9）将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。

应注意的是，Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后，要用自来水洗3 次，蒸馏水洗 2 次，然后倒置于一试管架上晾干后，称取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。

3.4 电泳

使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳，并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。

（1）聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25％，配制过程如下：

尿素 18g

Amberlite 离子交换树脂（Sigma，MB-lA） 约39g

40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml

去离子水 25ml

将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。

（2）取5ml 10 倍TBE，通过2μm 滤膜抽滤后，再抽滤以上胶液。

10 倍TBE 配方：

Tris-base 108g

硼酸 55g

Na2 EDTA（2H2O） 7.44g

定容至 1L

（3）将滤过液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％过硫酸胺（APS），轻摇混合后，用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中。

（4）1 小时后，将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟，恒压1kv，并使温度升至 51℃。

（5）预电泳的同时，取出 36 份―70℃下贮存的样品，各加入5μl 载样液（50μl 试剂盒中配备的loading buffer＋250μl 去离子甲酰胺，临用前配制）。

（6）将混合液在旋涡混合器上振荡，94℃下变性2 分钟，冰浴2 分钟后短暂离心。

（7）各取 1.5μl 点样，恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况，此时应人为修复。