DNA分子荧光探针

陈秀英 彭孝军*

(大连理工大学精细化工国家重点实验室 大连 116012)

摘 要 介绍了各种DNA 荧光探针的结构特征、荧光性质和与DNA 的作用方式，概述了DNA 探针在生物分子分析方面的应用，并展望了DNA 荧光探针的发展趋势和应用前景。

关键词 荧光探针 DNA 花菁染料 光稳定性 量子点

DNA Fluorescence ProbesChen Xiuying, Peng Xiaojun*(State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian 116012)Abstract The structure characters, fluorescence properties and the functional ways of the various kinds of probes for DNA, including some applications on the detection of biomolecules, were reviewed, and the trends and prospect on the progress of DNA fluorescence probes were discussed too.Key words Fluorescence probe, DNA, Cyanine, Photostability, Quantum dot

DNA 是生命遗传的重要物质，DNA 分子的定量分析和特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。由于生物分子自身的荧光较弱，目前多采用荧光探针法检测。荧光探针法较传统的同位素检测速度快，重复性好，用样量少，无辐射，在DNA 自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用[1,2]。DNA 荧光探针的灵敏度是影响检测结果的重要因素，因而开发更灵敏的荧光探针，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研究的热点。下面对DNA 分子荧光探针的结构、功能及对DNA 的分析应用技术方面作一介绍。

1 吖啶、菲啶类

吖啶、菲啶类染料是应用最早的核酸荧光探针，它们通过嵌入或静电吸引与DNA 分子结合，使DNA 的荧光大大增强，是序列非特异的小分子探针。吖啶的基本结构为二苯并吡啶，在水溶液中呈弱碱性。1940 年，发现当吖啶橙与酸性物质连接或存在于酸性物质中时，其特征光谱会发生一定的变化，至此一直被用于生物体的染色。吖啶橙可与DNA 或RNA 作用，与双链DNA(dsDNA)结合后的荧光激发/发射波长分别为 502/538nm(水)[3]。

为提高染料稳定性及荧光强度，大量的吖啶衍生物被合成。Pavel 等[4]合成了系列硫代吖啶，并用毛细管液相色谱对其定量纯化分析。Naofumi[5]合成了10-羧甲基吖啶酯，其荧光及稳定性都有很大提高，同时含有的羧基活性基可与生物分子共价结合。

Cao 等[6]在吖啶橙给体与番红T 受体之间建立了荧光共振能量转移(FRET)定量测定DNA 的方法，其中给体的最大发射波长要与受体的吸收波长重叠，对小牛胸腺DNA 的检测限为2.6×10-7mol・L-1。

该法虽然灵敏度较高，但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干扰。一些吖啶的络合物，会对小沟及DNA 序列特异识别，有望成为DNA 的转录抑制剂，控制核酸的表达[7,8]。对位氨基取代的喹吖啶化合物对三链DNA 有高度的稳定作用及选择性，而且该类化合物表现出光活性，成为DNA 的光切断剂[9]。

溴乙锭是应用较广的菲啶类探针，溴乙锭可结合单链(ssDNA)、双链及多链DNA，与核酸结合后，荧光增强20～30 倍，激发波长红移30～40nm，发射波长发生蓝移，Stokes 位移较大。

双嵌入剂乙锭均二聚物(Ethidium homodimer，EthD)的嵌入部分使染料分子与DNA 之间形成十分牢固的亲和力，连接常数约1011(溴乙锭仅为105)，同时对三链DNA 有高亲和作用，因而更利于应用到抗体、抗癌药物的基因水平的研究。

Gherghi 等[10]用汞滴电极研究了溴乙锭、吖啶橙与dsDNA 的作用，结果显示它们的作用方式完全不同。利用488nm 氩离子激光激发和共聚焦荧光成像扫描系统对EthD 与DNA 的复合物检测，琼脂糖凝胶电泳后，检测灵敏度可达pg(10-12g) 级[11]。

溴乙锭探针研究dsDNA 与树枝状大分子(Dendrimer)的相互作用[12]，对于细胞修复、分子识别等基因生命学有深远意义。富含碱基G 的ssDNA 可以形成分子内四链结构，溴乙锭的一些衍生物可以增加DNA 四链结构的稳定性并作为研究四链结构的荧光探针[13]。它们的一些光谱性质见表1[3,14,15]。

2 菁类染料

2.1 TOTO 类

吖啶橙、溴乙锭类染料虽然与核酸结合稳定，但未结合的染料自身的荧光会造成高的荧光背景，干扰检测，同时溴乙锭具有很大毒性。TOTO 和YOYO 是由Glazer 等开发的一类对dsDNA 具有高度亲和力的不对称菁染料[16,17]。

染料在溶液中无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰。与dsDNA 结合后发生强烈的荧光，荧光增强约1000 倍，染料分子与DNA 的碱基对最大比例可达1/4，在琼脂糖凝胶和丙烯酰胺凝胶电泳中稳定。它们分别由单体噻唑橙TO 和唑黄 YO 通过一个多亚甲基胺柔性链连接成二聚体。

YOYO 是TOTO 的类似物，只是其中用苯并唑替换了苯并噻唑。改变多亚甲基链两端的染料分子，可以得到不同的异二聚体TOTAB、TOTIN 等。该类染料还有POPO、BOBO 以及不对称单亚甲基菁染料PO-PRO、BO-PRO、TO-PRO、 YO-PRO 等，共轭链碳数增加，吸收及发射波长产生红移。

Rye 等认为ssDNA-TOTO 复合物稳定性及光谱性质的变化在于TOTO 头部基团与单链碱基之间的堆积作用和链上两个阳离子正电荷与DNA 骨架上的负电荷之间的库仑力共同作用的结果[18]。

TOTO 可高选择性地用于dsDNA 的非序列特异性的检测，它对所有的dsDNA 表现出极高的亲和作用，但更易嵌入dsDNA 的(5'- CTAG-3')2 位，大约是100 倍的选择性，其次是(5'-CTGA-3')2 位，大约50 倍的选择性[19]。Jason 等[20]用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO 与DNA 的双嵌入作用。…………