1) 当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行冻存。
2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3) 向培养瓶内加入3ml无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS；
4) 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min；
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入
注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：2ml 含10%FBS 的培养基（这里的培养基可以用DMEM就行或者其他的基础培养基）中，将悬液吸入15ml 离心管；
① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6) 1000rpm 离心 5min；
7） 离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；
8） 将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
9） 第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
