RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法(3)

第一节 植物病毒RNA 提取

大多植物病毒RNA 为单链RNA ，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA 提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

一、材料

提纯TMV病毒液（10mg/ml）。

二、设备

冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂

TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA 酶的双菌水。

四、操作步骤

1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。

7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意]

1、整个操作应尽可能在低温下进行。

2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。