TaKaRa RNAiso Reagent(Total RNA提取试剂)

本制品是一种快速方便的总RNA提取 试剂 ，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层)，RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。 RNAiso Reagent具有很强的广谱性，可以适用于各种样品的总RNA提取，提取过程方便快速，整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。 【 试剂 盒之外所需准备试剂】 氯仿、异丙醇、7 5 % 乙醇（ D E P C 处理水配制) 、RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.01%（v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。）

保存和运输 1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月，为保证试剂质量，建议于2-8℃下避光保存。 2. 可以在常温下运输。

RNA提取实验前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 1. 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。 2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

实验操作 1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。 2. 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 ① 倒出培养液，用1×PBS清洗一次。 ② 每10 cm 2 生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞 使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。 ③ 将内含细胞的裂解液转移至 离心管 中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞 ① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入 离心管 中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。 ② 向每5×10 6 个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。

C. 动物组织、植物材料样品 ① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。 ② 对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖， 然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 ③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。 ④ 12,000 g 4℃离心5分钟。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。 ③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置5分钟。