DNA芯片检测siRNA专一性

长片断的双链RNA (dsRNA) 导入例如植物，真菌，果蝇，线虫等 生物 的细胞中会引发同源mRNA的降解——这就是所谓的RNA interference (RNAi)。RNAi分两个步骤，首先是长片断双链dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25个碱基的small interfering RNAs (siRNAs)。这些siRNA随后和相关蛋白组合成为RNA-induced silencing complex (RISC) ，这个复合物以同源mRNA为靶摧毁mRNA。两年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳动物细胞中成功引发特异基因的沉默，从此siRNA广泛应用于这个领域。

siRNA介导的基因沉默通常要求高度的序列专一。Tuschl和同事证实siRNA和mRNA之间一个碱基的错配都会导致基因沉默的失败，当然这并不排除由siRNAs 引发的非特异基因沉默。siRNAs也有可能会引发一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超过30个碱基的长片断dsRNA一样通过引发抗病毒反应—— 一种通常由于机体对抗病毒入侵产生的反应，包括由蛋白激酶R和后继的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻断，以及由 RNase L激活的非特异RNA降解。

这就意味着需要在全基因组范围内对siRNA的专一性进行检测。2003年5月出版的 The Proceedings of the National Academy of Sciences, USA , Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法对siRNAs的专一性在全基因组范围内进行了检查。

Brown和同事检查了两个针对外源GFP基因的siRNAs的专一性，结论是关闭外源的GFP表达不会间接影响其他细胞内源基因的表达水平。2个GFP特异的siRNAs和两个随机无意序列对照siRNAs分别被转染能瞬时或者持续表达GFP的人源293细胞，结果通过GFP荧光水平检测和FACS分析，GFP特异的siRNAs能够沉默70%的GFP表达而对照则对GFP表达没有影响。从转染和没有转染siRNAs的细胞中分离RNA，标记后和点有36000个人类基因的cDNA 芯片杂交。其中约有20000个基因在293细胞中表达。结果表明这20000个基因中没有一个的表达水平在转染了特异或非特异siRNAs后发生显著变化。

对于RNAi 特异性的另一个关注焦点是：传递的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫"secondary siRNAs"的产生。Transitive RNAi是在线虫的实验中发现的，也可能在其他 生物 中发生。在这个过程中，siRNAs，在变性后结合到互补的转录本上，通过RNA依赖的RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3"和5"端的延伸形成新的双链dsRNAs。这些dsRNAs被加工成为"secondary siRNAs"。这些二级siRNAs，如果和其他基因有同源，可以导致其他基因表达的沉默，这样就强化了非特异基因沉默的可能性。

到目前为止，在人类基因组中没有发现 RNA依赖的RNA 聚合酶 (RdRP)，这提示在人类细胞中可能不会发生RNAi传递。然而这个假设并没有被广泛的验证过。Brown和同事也检测了在人源细胞中是否存在传递RNAi现象。他们将两个报告基因(luciferase and GFP)分别和常见的actin序列融合，共转染到293细胞中。他们检测到一个报告基因的特异的siRNAs不能导致另一个报告基因沉默。结果表明传递RNAi机制在人类中不存在。

研究结果支持已有的假设：siRNAs在高度序列专一的条件下发挥作用，只能导致完全互补的基因表达沉默。人类细胞不存在传递RNAi现象的实验结果同样证实这种专一性。

不过实验受限于细胞类型和siRNAs类型，特别是外源基因的siRNAs。实验结果仍然有待推广到其他细胞类型，特别是内源基因的siRNAs，如果siRNAs在将来要应用于基因治疗，这样的实验将尤为重要。