RNAi及siRNA转染相关实验攻略

RNAi 是一种高效的特异性强的基因表达抑制，应用RNAi生物学机制进行基因功能研究已经成为一种创新性的新方法，人们第一次可以如此快速和方便地抑制细胞中特定基因的表达水平，从而用于分析特定基因在细胞中的功能。RNAi 技术还为新药开发、疾病治疗提供了创新性的方法和途径，有着极其广阔的应用前景。转染是RNAi技术应用的瓶颈。siRNA的转染是RNAi技术最常用和最重要的转染。由于siRNA转染技术应用的时间不长，对广大实验室和研究者来说还相对陌生，即使一些有经验的研究者也有一些疑问和困惑。

　　一、详细实验

　　RNA干扰（转录后基因沉默）实验

　　细胞转染实验

　　二、常见问题解答

　　1、问：都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？

　　答：RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。

　　对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。

　　对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后不被溶酶体降解，并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用，更重要的是浓缩siRNA，不将细胞外的其他成分，特别是毒性成分，如抗生素、过多的蛋白带入细胞，以避免细胞产生毒性反应，毒性对RNAi实验来说，影响非常大。

　　2、问：最近用Entranster-R做NIH3T3细胞的siRNA转染，沉默效率在50％左右，请问如何提高沉默效率？

　　答：不知道您的具体用量，但一般可以从几个方面来提供沉默效率：

　　（1）优化siRNA和转染试剂的用量。具体优化方法可以在Entranster-R的说明书上看到。经过优化后，据我们和客户的经验，对NIH3T3，沉默效率应该可以达到80％以上。

　　（2）在沉默的峰值点观察结果，如在mRNA水平，可在24-48小时观察，在蛋白水平，可在更长时间如48-72小时观察。具体时间根据具体基因的表达情况确定。

　　（3）优化转染时的细胞数量。转染时较少的细胞数量，可延长观察时间，同时避免由于细胞密集造成的抑制。

　　3、问：21nt,22nt,24nt的siRNA如何进行电泳分辨？

　　答：可以采用化学修饰的方法，比如2'羟基甲基化修饰，磷酸硫代修饰，氟代修饰等常规修饰方法，都可以保证siRNA的稳定性，当然也有学者可以在siRNA的链后面悬挂两个单独碱基T。还有就是合成和纯化以及实验操作中的尽量注意RNA降解即可。PAGE分析，即聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以分辨1bp，实际上，在引物的纯化中也常用此种凝胶进行纯化。但由于siRNA很容易降解，尤其在电泳时，需要接触的液体、器皿等都很多，很容易造成在电泳过程中的降解，这样电泳就不易分辨了。如果一定需要分辨，可以采用HPLC或质谱的方法。

　　4、问：我在做shRNA质粒，用lipo2000转染U251细胞。这两天做了一次，用RT-PCR来看转染后抑制的效果。公司给我四个质粒、一个阳性对照、一个阴性对照。按照lipo的protocol，DNA：lipo比例为1：3，转染近30个小时提的RNA。结果出来让我有点茫然，四个质粒确实有抑制，抑制率大约在50%左右。但是问题出来了，阳性对照是针对GAPDH的，但是我阳性对照的GAPDH跑出来条带非常亮，而阴性对照却基本没有GAPDH。应该不是加样加错了？楼主能不能帮我分析一下？

　　答：（1）四个质粒都有抑制，包括阳性和阴性对照，都在50％，如果是，阴性质粒是不应该出现抑制的，可考虑增加转染试剂对照，即不加任何质粒，只加转染试剂，或者换一种转染试剂，看是否是lipo2000转染试剂造成的抑制。（2）如果是阴性对照呈阳性，而阳性对照呈阴性，当然首先得排除操作中混淆的错误，可以再重复一次实验。

　　（3）转shRNA质粒，建议可以时间再长些，如48-72h再提RNA，观察结果。

　　5、问：想请教下有人提到siRNA与lipofectamine2000的最适比例为1：1或1：2，这是什么比例呢？我看一般siRNA以pmol为单位，而lipofectamine2000是以ul为单位。还有就是siRNA的终浓度问题，一般文献中提到转染时siRNA的终浓度为100nM,这是指与稀释后与脂质体混合后的浓度，还是指培养板中加了生长培养基后的终浓度呢？还有荧光如何计算它的转染效率呢？那在荧光显微镜下怎么选取视野来计算呢？取三个视野后算平均值吗？

　　答：不同的细胞，不同的基因，用量是不一样的。终浓度指：细胞接触的液体的终浓度，即含培养基的浓度。带荧光的siRNA，可以通过荧光显微镜、流式细胞仪等来看。有荧光的细胞所占比例就是转染效率。精确的方法是用FACS，荧光显微镜下可以选有代表性的视野估计。多选几个视野，如你说的3个，当然更为可靠。

　　6、问：想请教个问题，我是用lipofectamine2000来转染，细胞本身有些小黑点，但不严重，细胞形态功能都还可以，但是在加了转染试剂之后细胞间就出现很多很多小黑点，背景很不干净，实验组，阴性对照组和Mock组都是一样的情况，但正常组（不加转染试剂）的细胞就很好,72h后mRNA检测实验组几乎没有抑制，请问这是转染试剂的原因吗？

　　答：应该先确定一下“小黑点”的性质，不过根据你的描述，应该和转染试剂有很大关系。脂质体类的转染试剂多对细胞毒性较大。

　　7、问：慢病毒转染多长时间后进行干扰目的基因和蛋白的检测？

　　答：如果用慢病毒进行瞬时表达，一般至少需要24-48小时，慢病毒基因组是RNA，需要反转录成DNA，再生成siRNA，再干扰，才会发生作用。这个过程和细胞类别、细胞活性、慢病毒具体载体等等有关系。建议取不同时间点检测。另外，慢病毒一般都带筛选基因，可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达，可考虑用转染试剂，成本、时间、方法都要省很多。

　　8、问：ipo的说明书中说到，用96孔板，可以在板内直接混合lipo、DNA，然后再加入细胞。但是有点疑问，按照说明书说的，lipo、DNA都需要和opti-MEM预混合，然后再将两者的溶液混合孵育，不知道直接加到板子里面时，加样顺序怎么弄？是先加opti-MEM，然后加DNA，然后再加opti-MEM，再加lipo，混合孵育么？

　　答：lipo2000的说明书有好几个版本，有一版说明书是不用于转siRNA的，后来又改成可以转siRNA，但推荐用RNAimax这款siRNA专用的转染试剂，你看的应该是其96-well反向转染的说明书。是会让人费解。其实是，先在一个容器用opti-mem稀释lipo，再在板子里用opti-mem直接稀释DNA或siRNA，然后将稀释的lipo加入到板子上，最后加细胞。

　　9、问：我最近也在做转染，可是发现转染后背景很脏，都是黑点（疑似黑焦虫）在原地运动。做了LB检测，确定该黑点不是细菌，最后发现黑点来源于抽提的质粒，请问LZ有什么办法可以解决吗？我已经用试剂盒重新抽提过N次质粒了还是这样？

　　答：这种黑点，如果确定不是细菌，多是凝聚的蛋白，还有DNA等的沉淀产物，有人又把它叫“黑胶虫”。人们看到可以动，认为是生物，其实只是布朗运动。这和血清、细胞、转染试剂等都有关系。如果不影响实验，可以通过换液来除去。