RNAi在哺乳动物中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(doublestrandsRNA，dsRNA)引起的，广泛存在于动物植物中的序列特异性转录后基因沉默过程，是生物体在进化过程中，抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制。

Elbashir等[1]发现，一种称为短干扰或小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)的RNA干扰中间体，能在果蝇中导致mRNA的降解。这种iRNA为21个核苷酸，形成19bp的双链RNA分子，3′端有2个核苷酸突出(overhang)，可激活哺乳动物细胞的RNAi机制。

1 RNAi的机制

RNAi在哺乳动物中的机制基本上与果蝇和其他低等生物中RNAi的机制相似[2，3]。基本步骤由启动和效应步骤构成[4]，启动步骤为较长的双链RNA经过RNA酶Ⅲ核酸酶(Dicer)处理后，降解成21～23个碱基的siRNA，siRNA与靶mRNA有高度的序列特异性。

siRNA在3′端有2个碱基突出。效应步骤为siRNA与RNA酶结合形成一个RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC是分子质量为50ku的内源性核酸酶，并与siRNA序列互补的内源性mRNA结合，核酸酶在siRNA2mRNA结合体3′端大约12个碱基处切割mRNA，使之丧失转录信息，达到特异性抑制目的基因表达效果。

2 RNAi在哺乳动物细胞中的应用

2.1体外合成siRNA

如何实现哺乳动物细胞中RNAi，目前使用得最多最广泛的是siRNA双链复合体(depluxes)。

siRNA双链复合体是根据靶mRNA序列设计的21个核苷酸的双链，由一条正义链和反义链组成，其中正义链19个核苷酸序列与靶序列相同，3′端有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，反义链19个核苷酸序列与正义链互补，3′端也有2个碱基突出，一般为dTdT或UU，3′端dTdT结构对siRNA双链复合体的稳定性有很大贡献，而3′端UU结构有利于siRNA介导的基因沉默。

研究哺乳动物RNAi机制的学者建议，最有效的双链siRNA序列应该是与靶mRNA序列互补的19个核苷酸序列，外加3′端2个碱基突出构成21个碱基的双链RNA，研究表明[3]siRNA双链的反义链具有识别靶点基因序列的功能，而正义链没有序列识别功能。

在设计双链siRNA时，通常将mRNA开放阅读框区域作为作用靶点，从启动子下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的靶序列。为了避免mRNA调控蛋白的影响，3′端和5′端非翻译区域或者启动子不应该作为作用靶点。

Tuschl等在化学合成21～23ntsiRNA方面的研究取得了很好的成绩[5]。目前已经有多家公司可以提供siRNA化学合成服务，比较著名的有Dharmacon(www。dharmacon。com)、Qiagen(www。giagen。com)、Proligo(www。

proligo。com)和Ambion(www。ambion。com)等。厂家可进行siRNA序列设计和合成，他们采用(AA2N19)标准进行siRNA设计，即19nt+dTdT或UU，19nt序列基础上在3′端加2个碱基。

研究者也可以根据自己的需要进行设计，RNA最大合成碱基数量为80nt，为了防止siRNA的降解，siRNA通常采用了碱基保护措施，使用前根据试剂盒提供的缓冲液和步骤去保护。采用2′2ACE技术保护的合成RNA冻干粉，在-20℃可以保存1年。

另外，siRNA的保存时间与siRNA自身序列、所采用的保护方法、保存温度等因素有关。2p-OH形式的RNA可以保存6个月。研究表明，以AA-N19标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%有RNAi作用。

AA-N19设计原则:从启动序列下游75个碱基开始寻找第一个AA序列，确定AA序列之后的19个碱基序列为目的序列;计算AA2N19221序列中的G/C含量比值，G/C含量应该在30%～70%之间，最好为50%。

如果在此序列中G/C含量不能达到要求，继续寻找下一个AA序列，直到获得满意结果。在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性。如果未达到要求，重新设计。

按照Tuschl等设计原则[5]，AA(N19)TT模式是最理想的siRNA序列，如果靶点基因序列中没有理想中序列，AA(N21)或CA(N21)序列模式可以作为siRNA替代序列，由于双链siRNA中的正义链并不参与靶点序列的识别，所以正义链的设计可以用dTdT替代。

已经有多个实验室按照Tuschl等设计原则，设计的siRNA取得了很好的RNAi效果。但是从多个方面反馈的信息表明，siRNA的设计并不一定要严格遵守AA序列起始原则。QIAGEN公司根据现有的研究结果和客户的反馈意见，对Tuschl的AA原则进行了修订和补充。

认为mRNA 21个碱基中G/C含量应为50%，这比确定AA起始序列更重要。另外序列中应该避免连续同时出现3个鸟嘌呤碱基对，多个G序列重叠形成的多聚体将大大减弱siRNA的阻断作用。以下是QIAGEN公司的siRNA设计原则。

第一，在mRNA编码区选择21个或23个碱基序列，序列中GC含量比值尽量接近50%。理想的GC含量比值为45%～55%，上限60%，超过70%作用明显减弱。50～100nt的AUG启动子和50～100nt的终止子区域应该避免。

第二，在一排序列中避免出现3个以上的鸟嘌呤。PolyG序列可以重叠，因此形成块状结构，严重影响siRNA的作用效果。第三，优先选择AA起始序列。如果选择AA起始，对应的siRNA3′端碱基突出可以为dTdT，从RNA合成的角度来讲，可以大大降低RNA合成成本和增加siRNA对核苷酸酶的抵抗性。

如果难以发现AA起始序列和满足第一、第二条原则，选择另外23nt编码区域，继续按第一和第二条原则重新选择。第四，确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性。在GenBank中用BLAST软件查对，确保靶序列的唯一性。根据客户的反馈意见，正义链3′端的标记不影响siRNA的效果。

依照上述原则设计的siRNA，80%有效。为了确保满意的RNAi实验效果，建议设计2条以上不同序列的siRNA。上述的设计没有考虑mRNA的二级结构。研究表明[6]，相对于反义RNA和核酶技术，mRNA二级结构对siRNA的作用没有明显的影响。

体外合成的siRNA必需导入细胞内才能诱导RNAi，因此，如何有效地导入siRNA，成为研究热点之一。研究表明，以往在基因治疗中使用的载体可用于某些siRNA的导入[7]，目前使用最多的是阳离子脂质体载体。

2.2细胞内合成siRNA

由于体外合成siRNA在细胞内的作用，受到转染技术和效率的影响，另外体外合成siRNA成本较高，体内表达短暂。因此研究者一直在寻找哺乳动物体内表达siRNA的方法，拓宽RNAi技术的应用范围。研究表明，在体外构建siRNA表达载体，通过启动子诱导表达，在细胞内产生siRNA，触发RNAi，是一个切实可行的方案(图2)[8～10]。

Brummelkamp等[11]采用RNA聚合酶ⅢH12RNA作为启动子，用pSUPER质粒作为表达载体，以DNA为模板在哺乳动物细胞内合成siRNA，在10多种细胞中取得满意的抑制特异基因表达效果，并且在细胞中表达时间长，对细胞无毒性。

设计插入序列时，环路结构(loops)的大小和序列至关重要，直接影响所得siRNA的抑制效果。在机制方面，认为首先由DNA模板产生一个stem2loop前体，在细胞中切割后，变成具有功能的siRNA。作者认为该技术是高通量筛选基因功能缺失表型的有效方法。

同样，Paddison等[9]用发夹RNAs也取得了成功。将siRNA序列的DNA模板插入RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)的转录单位(基于核RNAU6或人类RNasePRNAH1转录单位序列)。

因此利用表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA是体外合成siRNA有效的替代方案，具有表达时间长、作用持久和成本低等特点，更接近生物体产生RNAi现象的自然机制，是未来RNAi研究的方向。