RNAi 实验介绍

1. RNAi 介绍 RNA 干扰（RNAi:RNA interference）是由诺贝尔生理学/医学奖得主 Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello（1）在线虫实验中发现的，2001 年 Elbashir 等人发现哺乳类的 siRNA 可以进行 RNAi 诱导。这个方法与常规方法相比更加简便，现在已经成为一种常用的抑制基因功能的方法，也属于研究工具之一。 RNAi 是 21~23bp 的短链双链 RNA（siRNA:small interfering RNA）或者是长链双链 RNA（dsRNA:double-strand RNA），与目的基因表达的 mRNA 同源区进行特异性结合，使 mRNA 降解，达到抑制基因表达的作用。 RNAi 活性与转位子的移动、基因表达抑制和细胞命运决定有关。并且是防止病毒感染的重要因子之一。RNAi 的发现对核酸医药研究和基因治疗的应用有很大帮助。 （1）Fire, A.at al .,Nature 391: 806-811 （2）Elbashir SM, at al :Nature 411:494-498 2. RNAi 实验用品 RNAi 实验用品大致可以分为「将 siRNA 导入细胞诱导 RNAi」和「检测 RNAi 效果」的试剂、设备等机器。必须的机器、试剂如下所示： 细胞培养设备——CO2 培养箱和超净台 siRNA 样品——合成 siRNA、sh/siRNA 载体 导入 siRNA 的试剂、仪器——转染试剂、电穿孔、病毒载体 n 检测 RNAi 效果的试剂、仪器——RT-PCR、报告基因载体、分光光度计、荧光显微镜、荧光分光光度计、Northern Blotting 装置和定量系统 3. siRNA 干扰效果 3.1 siRNA 的形式决定 RNAi 干扰效果 我们需要根据研究对象的细胞和基因的特征，去选择合成 sh/siRNA 形式的表达载体。如果实验对象是哺乳动物细胞，使用培养细胞时需要确定以下两点： 使用的 siRNA 是否能有 RNAi 干扰效果/目标的序列是否有效序列 n 目的基因是否容易敲除

3.1.1 合成的 siRNA 直接用合成的 siRNA, 属于瞬时转染。 可直接购买市售商品或定制合成的 siRNA。 对照 siRNA:Cosmo 对照 siRNA、Wako 对照 siRNA 3.1.2 质粒载体或者病毒载体 基本都是瞬时转染，但是可以建立稳定细胞株（稳定转染）。使用病毒粒子时会被基因组整合，可以构建稳定细胞株。 构建质粒或者病毒载体，要从以下三点开始考虑： A. 启动子：聚合酶 II 或聚合酶 III 系统 B. 载体：质粒载体或者病毒载体 C. RNA 表达方法：siRNA 表达系统或者 shRNA 表达系统当使用原代培养细胞或者非分裂细胞等难以转染的细胞时，除了慢病毒载体外，也可以使用比病毒更安全的 GenomONETM -Neo EX HVJ-E 仙台病毒包膜转染试剂，无需包装病毒，直接将 siRNA 与病毒包膜溶液混合，按照常规流程转染，即可达到病毒转染的效果。缩短实验周期，根据结果，灵活更换 siRNA 序列。 3.2 siRNA 序列设计 了解了 RNAi 的干扰机制后，需要设计既能避免脱靶又可以高效敲除的 siRNA 序列。可以使用免费使用的设计工具，也可以直接购买已经设计好的产品。 3.2.1 使用合成 siRNA 请根据商品说明书使用。 3.2.2 构建 si/shRNA 表达载体 即使设计好了 siRNA 序列，也不一定能够适用于载体表达。这是因为在细胞内从载体表达到 siRNA 产生的过程与很多因素有关。如果需要用到载体，则实验计划就必须考虑这一点，最好设计一个载体也适用的序列。 进行 shRNA 序列设计的同时合成对应的 siRNA, 能够有效的进行预备试验，在体外验证 siRNA 的功能。 3.3 合成 siRNA 的方法 siRNA 是在 3『末端的突出端含有两个碱基的 21~23 个碱基的双链 RNA, 通常经过退火处理后即可使用。 3.3.1 购买退火处理的双链 siRNA siRNA 序列指定：一般指定目标基因序列 碱基数指定：基本 21~27 碱基 悬突体指定：寡 RNA 或者嵌合寡 RNA-DNA 有义链和反义链之间不对称的地方会列出 通常含有退火缓冲液，没有的话会列出 *有两碱基的悬突体通常会用于胸腺嘧啶和尿嘧啶。当然使用其他悬突体对 RNAi 的效果也没有太大的影响。但是为了使 siRNA 末端平滑，通常会使 5 末端悬突，如果改变悬突体的长度有时候会影响 RNAi 的效果 Elbashir et al., EMBO J,20:6877-6888 例：siRNA 指定序列 目的基因序列：5’ - CGGAAGATGAAGAGGAAGA - 3’

3.3.2 购买单链 RNA 购买单链 RNA 后也可以亲自进行退火操作 可以选择使用寡 RNA 或者嵌合寡 RND-DNA 通常 RNA 的糖链中 2′会有保护基，需要先进行脱保护*2001 年曾经有报告指出从目的基因的 AA 开始 19 碱基的配合序列比 RNAi 的效果更好。所以大多数研究人员开始使用以 AA 开始的 19 碱基作为 siRNA 的目的序列，文献上会写成 AA+19. 根据这些文献的资料 [AA+19+2 延伸的悬突体（合计 23 碱基），合成双联 siRNA 时，合成出的序列会和文献上记载的不同。 （1）Nature , 411, 494-498, 2001 （2）EMBO J., 20, 6877-6888, 2001 （3）Genes Dev., 15, 188-200, 2001 3.4 si/shRNA 表达载体的构建 决定了使用的 si/shRNA 序列和表达载体后，然后就要决定进行亚克隆位点。一般情况，启动子从 polIII 开始作为转录起始位点。 需要注意，它与碱基序列（嘌呤碱基）相关。 3.4.1 插入设计的序列

3.4.2 获得 oligoDNA 如下所示获得两条 oligoDNA

退火后，启动子连接到载体，亚克隆通过测序检测。 3.5 阳性对照和阴性对照的选择 继续 RNAi 实验时，需要同时进行阳性对照 siRNA 和阴性对照 siRNA 实验。阴性对照实验进行时需要使用与所有基因序列不同的序列（就是说没有 RNAi 效果的序列），阳性对照实验需要使用高效的 RNAi 序列。需要提前确认进行 RNAi 细胞 RNAi 的干扰效果（RNAi 效果的持续性和表达抑制效率）和再次进行独立实验确定重复性。但是 DNA 质粒和合成 siRNA 的转染的最适条件不一样，必须要使用最适合合成 siRNA 的条件。 *可以使用以下三种中其中一种： 市售的对照 siRNA（基因组上不存在的序列） 根据目的基因特异性 siRNA 序列，不改变 G、A、U、C 各种核苷酸的比例只随机改变序列，做出在基因组上序列不同序列的 siRNA 3.6 siRNA 转染细胞后 siRNA 的纯化 当进行 siRNA 药理研究时，RNAi 后需要纯化 siRNA，来研究 RNAi 效果、siRNA 代谢过程、体内 siRNA 的稳定性、毒性/副作用、非特异性 mRNAs 的脱靶效应。 可用小 RNA 纯化试剂盒，或者 Ago1~Ago4 抗体，得到纯化的 siRNA. 4. 细胞转染 4.1 决定转染方法 使用合成 siRNA 或者 si/shRNA 表达载体进行 RNAi 干扰实验时，须导入到细胞中。如果有培养细胞的设备，只需要确定转染的方法就可以了。 目前市面上有各种类型转染试剂，脂质体转染试剂、病毒型转染试剂、多聚物转染试剂、体内转染试剂等，可以根据试验需求选择合适的转染方法。 4.1.1 使用合成 siRNA 和质粒载体 由于是瞬时转染，所以要尽可能提高转染效率。需要根据使用细胞的转染效率和细胞毒性等性质来决定转染试剂的种类和是否使用电穿孔法。 4.2 研究转染条件 使用转染试剂（以下只是举例，详细请参考转染试剂的说明书） 1）在 6 孔板中培养细胞，24 小时后达到 50~70% 融合。 2）在 MEM（无血清）中加入阳性对照 siRNA（1μL 100μM 的样品）。如有 GFP 等报告载体存在时，可以进行共转染。 3）调整各种转染试剂的浓度 A: 在培养基（无血清）中添加 1μL 转染试剂最终变成 100μL. B: 在培养基（无血清）中添加 2μL 转染试剂最终变成 100μL……等。 4）将第 2 步的 siRNA 溶液分别添加到第三部调整好的转染试剂中，充分混合，在室温 15℃ 下静置。 5）用培养基清洗细胞后，添加 0.8 mL 培养基（无血清）。 6）将第 4 步中调整好的 siRNA 转染试剂复合物，分别滴到培养板中 7）培养数小时 8）添加 1 mL 含有正常剂量的血清和抗生素的 MEM, 培养 24~48 小时。实际上这是为了确认转染试剂和导入 siRNA 后是否发生其他问题，必须要从在 siRNA 存在和不存在，这两方面确认。需要选择细胞毒性低敲除效果好的条件。

5. RNAi 实验中要注意的地方5.1 目的基因的选择5.1.1 确定目的基因的表达量5.1.2 尽可能获得 mRNA 和蛋白质的转录信息如果目的基因无法表达，RNAi 诱导实验则不能进行。细胞或者基因自身的周期等因素对 mRNA 表达造成的影响也很重要。同时需要根据 mRNA 的寿命和代谢时间优化实验条件。5.2 决定使用的细胞系根据研究目的选择使用的细胞系，但是细胞系不同，有可能难以导入 siRNA 或者细胞内 RNAi 干扰核心的 DICER 和 RISC 水平不同，产生干扰素反应活化等。另外，特别是进行瞬时转染时，要达到 siRNA 高效转染，首先应该使用容易转染的细胞去确认 siRNA 的敲除效果。5.3 尝试多种 siRNA如果 1 种 siRNA 无法得到期待的效果，可以对一种目的基因使用多种 siRNA 进行敲除实验。另外，也需要确定使用不同有敲除效果的 siRNA 会不会得到同种表现型。这是因为多数 siRNA 引起的脱靶反应几乎不会一样。5.4 siRNA 的保存方法5.4.1 要小心酶引起的降解和机械分解1）保存在 RNase-free 的环境中。2）使用的试管、水或者缓冲液都要是 RNase-free.3）分装保存，避免反复冻融。5.4.2 溶解方法按照说明溶解合成的 siRNA, 然后调整调整储存母液浓度。合成浓度应该在 200μm 以下，一般是 50~100μM.5.4.3 保存方法1）干燥状态在-20℃ 下可以保存一年。2）溶解保存反复冻结然后溶解会导致 siRNA 分解，所以需要根据实验剂量考虑是将 siRNA 溶液分装还是冷冻保存，-20℃ 以下可以稳定保存半年。要注意冷冻箱内的温度上升导致冻结溶解。5.4.4 实验注意事项一旦溶解后将 siRNA 保存在 4℃ 时，一星期内可以用于实验，这仅限于在 RNase-free 的状态。保存时要十分小心，一旦 siRNA 活性降低，将它冷冻保存并使用储存的母液 .5.5 RESCUE 实验将有 siRNA 不能识别的核酸序列的目的基因导入就能够将表现型重置，所以有几种可以作为 RNAi 的 RESCUE 实验 n 导入目的基因的变异核酸序列对应目的基因的 cDNA 克隆，不改变野生蛋白质序列直接导入变异核酸序列，就能够确定 siRNA 效果是否 rescuen 使用标记 3′UTR 的 siRNA 和 ORF 克隆使用标记了 3′UTR 的目的基因 siRNA 进行敲除实验就能确定表现型。然后使用在 CDS 域的 ORF 克隆编码（open reading frame clone）进行 RESCUE 实验。*难以调节目的蛋白质的表达量，而且如果过剩表达可能会产生危害，所以 RESCUE 实验是一种难以使用的方法。6. 使用 RNAi 技术的体内实验和体外实验对应 siRNA6.1 合成 siRNA6.1.1 没有末端修饰可以没有末端修饰的 siRNA（nakid-siRNA）的方法和 2′-OME,2′-F 等有末端改性基的 siRNA 的方法。6.1.2 合成 siRNA 的纯度In vivo 实验中使用的 siRNA 纯度要尽可能高，产品最好是不含内毒素并且是在 GMP 准许制作设施中制造。6.2 siRNA 表达载体有双链 siRNA 表达系统、拥有发夹结构的 shRNA 表达系统等，涉及 siRNA 表达方式、驱动 siRNA 的启动子种类等。6.3 慢病毒系统慢病毒系统可以通过核膜，不受细胞分裂期影响，能够将片段整合到宿主基因组中。已有报道可以导入到脑或者神经细胞中。如果您担心病毒的安全性问题，可以用 GenomONETM 替代病毒转染。参考文献使用 Naked-siRNA 和 siRNA 表达载体McCaffrey et al., Nature, 418:38-39, 2002.Chang et al., J. Virol, 75:3469-3473, 2001.Heidel et al., Nat Biotechnol, 22:1579-1582, 2004.Song et al., Nat Medicine, 9:347-351, 2003.使用化学改性的 siRNASoutschek et al., Nature, 432:173-178, 2004.Morrissey et al., Nat Biotechnol, 23:1002-1007, 2005.Elmen et al., Nucl Acids Res, 33:439-447, 2005.使用 Lentiviral SystemDittgen et al., ProNAS, 101:18206-18211, 2004.Singer et al., Nat Neurosci, 8:1343-1349, 2005.Clements et al., Tissue Eng, 12:1741-1751, 2006.使用载体Reich et al., Mol Vis, 9:210-216, 2003.Li et al., Nat Medcine, 11:944-951, 2005.