原位PCR和原位RT-PCR操作规程

原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术,就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。

一、仪器设备

英国Thermo Hybaid原位PCR仪。

二、操作流程

1、原位PCR步骤

（1）预处理：a、切片常规脱蜡；

b、0.2mol/L HCl处理10min；

c、5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；

d、Nase消化组织37℃ 30min；

e、梯度酒精脱水，室温干燥。

（2）原位扩增：a、切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；

b、PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25~30个循环，72℃延伸10min；

c、氯仿洗去盖玻片，4%多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。

（3） 原位杂交：a、加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。

b、杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次；

c、缓冲液洗涤10min，3次；

d、加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；

e、缓冲液洗涤5min，3次；

f、NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色；

g、常规脱水：透明、封固。

2、原位RT-PCR步骤

（1）预处理：a、蛋白酶K（0.3mg/mL） 54℃消化20min，蒸馏水洗；

b、95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。

（2）原位扩增：a、在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；

b、用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；

c、扩增结束后，在80℃烤15min~30min。

（3）原位杂交：a、杂交前标本95℃加热3min；

b、加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25%硫酸葡聚糖，2×SSC，50%甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA， 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。

c、扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600（链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝）检测。阳性反应呈紫色。