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PCR技术

等位基因特异性PCR

PCR
2024-05-13 PCR技术 加入收藏
简介等位基因特异性 PCR,也称错配 PCR(mismatch PCR), 扩增耐突变系统(amplification refractory mutation

简介

等位基因特异性 PCR,也称错配 PCR(mismatch PCR), 扩增耐突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS), 错配扩增突变分析(mismatch amplification mutation assay,MAMA),是相较单链构象多态性分析(single stnmd conformation polymorphism,SSCP)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、异源双链分析(heteroduplexanalysis,HA)更为简便、快速,易于检测大量标本的 PCR 方法。

原理

等位基因特异性 PCR 的基本原理是,Taq DNA 聚合酶缺少外切酶活性,在一定条 件下,PCR 引物 3' 末端的错配导致产物的急剧减少,针对不同的已知突变,设计适当的引物, 可以通过 PCR 方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。该方法要求制备 3 个 PCR 引物, 其中 2 个引物分别含有待测 DNA 中突变位点的突变碱基及正常碱基,另外一个为正常对侧引 物。当分别经过 PCR 扩增后,正常引物仅将正常 DNA 扩增出,而含突变碱基的引物将突变 DNA 链扩增出,然后用普通琼脂糖凝胶电泳检测有无扩增产物。

根据基因组已知的突变区及保守区,设计出三条引物,其中上游引物设计 2 条,其区别仅为 3' 末端的碱基不同,一个为等位基因 1 特异的引物(ASP1, 3' 末端为 A),另一个为等位基因 2 特异的引物(ASP2, 3' 末端为 C),下游引物(CON)设计在相对保守的位置。然后对于含有等 位基因 1 和等位基因 2 的基因组,分别用 ASP1. ASP2 与下游保守引物(CON)配对进行 PCR, 反应条件相同。再后进行结果检测。当用等位基因 1 DNA 为模板时,用 ASP1 与下游保守引物(CON)配对进行 PCR 得到了有效扩增,而用 ASP2 与下游保守引物(CON)配对进行 PCR 则 无扩增;当用等位基因 2DNA 为模板时,用 ASP2 与下游保守引物(CON)配对进行 PCR 得到 了有效扩增,而用 ASP1 与下游保守引物(CON)配对进行 PCR 则无扩增。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪。

试剂:

① 模板:基因组 DNA 或血清。

② dNTP 混合液:每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L。

③ 三条特异引物:浓度均为 10pimol/L。

④ Taq DNA 聚合酶。

⑤ 10 × PCR 缓冲液:15 mmol/L MgCl2,500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris-Cl,0.1%(体积分数)Triton X-100。

⑥ 高压灭菌去离子水。

⑦ 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

步骤

等位基因特异性 PCR 的基本过程可分为如下几步:

(一)引物设计

这是等位基因特异 PCR 最为重要的一个环节。根据已知的等位基因突变,将引物的 3' 末端设计在恰好可能发生突变的位置。其中一条引物可以与等位基因 1 片段完全互补(3' 末端与等位基因 2 不匹配),另一条引物与等位基因 2 片段完全互补(3' 末端与等位基因 1 不匹配),反向引物设计在较为保守的区域内,扩增的片段通常在 300 bp 以内。(见注意事项 ②)

(二)模板

一般使用经过提取的基因组 DNA(约 50 ng),也有使用血样纸片的报道。

(三)操作方法

1. 设立 50 μl 的 PCR 反应体系,至少配制两管反应液,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入以下成分。

注:ASP1:等位基因 1 特异的引物;ASP2:等位基因 2 特异的引物:CON:下游引物。

如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

2. 设置 PCR 反应条件

3. PCR 产物的检测和分析:反应结束后,用 10 μl 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。若试验成功,含有等位基因 1、2 的引物应当分别在其相应的模板上有扩增。

也可以用较为复杂的检测方法来进行分析,王瑞恒等将 PCR 产物经 ABI Prism™ 310 Ge-netic Analyzer 电泳分离。取 1 μl PCR 产物,加至 12 μl 甲酰胺中,再加入 0.5 μl GeneScan™ Size Standards LIZ-500(橙色)作为内标,毛细管电泳 25 min.(1.5kV,POP4 凝胶,47 cm 毛细管)。电泳结束后,用 GeneScan™ V3.0 分析。根据产物长度和产物峰的数量进行 SNP 分型,确定每个 SNP 位点的基因型。

注意事项

① 在等位基因特异性 PCR 中,如何来控制假阳性产物的出现是一个很关键的问题。通常先 从 PCR 的反应体系及反应条件入手,采取的方法有降低 PCR 反应的 Taq 酶量、引物浓度、 dNTP 浓度,提高退火温度等。每次反应的最适条件需通过几次不同的预实验来确定最佳组合。

② 引物设计时,要注意错配的位置必须在引物 3' 的最后一个碱基,否则将导致不能很好地 判断突变是否发生。偶尔,引物 3' 末端的错配不足以达到预期的分辨水平,特别是当突变型对野 生型的比例较低时更是如此,此时,在 3' 末端的倒数第二或第三个碱基处人为地引入错配,可以 很明显地提高分辨率。

③ 通常,在等位基因特异性 PCR 中,仅使用一对引物容易产生假阴性结果,将多重 PCR 方 法引入,及在所需扩增的 PCR 产物的外围再设计一对或一条引物,可作为内部的阳性对照,避 免假阴性结果的产生。



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