RT2 Profiler PCR Arrays新手小技巧及注意事项

以下是做了几百次PCR Array的Matt Finley博士的经验之谈：RNA纯化和分析:

起始RNA样品的质量是成功实验的最重要的因素之一。我强烈推荐使用QIAGEN的RNA纯化试剂盒来进行RNA纯化。

RNA样品必须进行柱上DNase处理，以保证你的RNA的纯度。假如你的样品很特别，需要选择一个最合适的试剂盒进行纯化，请致电或e-mail联系QIAGEN技术人员，他们很乐意帮您选择一个合适的试剂盒。确保RNA样品适合进行PCR array。RNA样品进行PCR array实验前必须先通过吸光值的测定来检验RNA的浓度和纯度，并通过凝胶电泳或者微流体、毛细管电泳等方法进行RNA完整度的测定。对于浓度和纯度，吸光度260/280和260/230的比值必须>1.8，浓度>100 ng/ul。

对于RNA完整性的分析，如果用凝胶电泳分析，28S/18S比值必须>1.5；如果借助微流体、毛细管电泳仪分析，RIN值（Agilent bioanalyzer测定的RNA完整度）或RIS值（QIAGEN QIAxcel测定的RNA完整度）必须大于7。

假如对您的RNA样品质量还有疑惑，请将这些质控数据发送给QIAGEN技术人员，我们会帮您分析您的RNA样品是否适合进行PCR array。cDNA合成：

我推荐以1 ug的总RNA为模板，用RT2 First Strand Kit (Cat # 330401)试剂盒进行cDNA合成。根据我们的经验这是最佳的起始反应用量。

假如RNA量不够，起始总RNA样品量最少可以减至400 ng，不过必须保证RNA的质量足够好；假如连400 ng的RNA样品都无法保证，请联系QIAGEN技术人员，您可能需要进行预扩增。请使用相同起始量的RNA进行cDNA合成及后继实验，以保证各组实验结果间的可比性。进行PCR Array实验：

关键：加完样后，将PCR板以1000 X g离心2-3分钟。

请严格按照PCR array用户手册设置PCR程序。我们针对不同类型的荧光定量PCR仪，程序进行了各自不同的优化，所以不同类型仪器的程序请勿混用。

程序运行结束后，基线可使用自动设置，但阈值必须手动设置。实验中所有需要数据相互比较的PCR array阈值必须设置成相同的数值，这样数据间才有可比性。具体的阈值设置点可根据实际实验结果调整，我们推荐设置在扩增曲线的下1/3处，使得PPC孔（标准96孔板式在H10-H12）的Ct值在17-19左右。数据分析：

为了更好的了解我们的免费在线数据分析工具，您可以先看一下我们的相关在线技术讲座。数据分析前请确认两点：每个PCR array实验使用的初始RNA量是相同的；读取Ct值时每个PCR Array的阈值设置都是相同的。

您的数据必须使用老版本Excel格式（即文件扩增名是.xls），我们的软件才能识别。如果您用了一次检测4个样品的384孔板，请参见最后的注释*。正确选择您的PCR Array货号。如果您使用的是2012年5月以后的产品，产品货号后面会有个“Z”，您在分析的时候也必须选择带有“Z”的货号。货号的形式是“PAXX‐###Z”。PCR array板的包装纸醒目位置标有您的PCR array货号。“Z”字母后面的数字和字母与您的PCR仪器有关，不影响数据分析。3个RTC孔Ct值之间的差值必须小于1；3个PPC孔也是如此。基因组DNA污染检测孔（GDC）的Ct值必须大于35，或者无检测信号。假如小于35，请确认柱上DNA消化步骤进行是否完全。RTC与PPC孔Ct的差值必须小于5。分析软件会自动寻找最佳的看家基因进行标准化数据。我们会尽量选择各组实验中Ct值相差在1以内的作为看家基因。*关于使用384孔板分析4个样品的详细注解：首先使用“96 Genes X 4 Samples”辅助工具，将4个样品的数据分开。将384 Ct值粘贴到黄色列内。如果使用的是预制的PCR Array，则不需要在红色列内填入数据，输入货号就会自动填入基因名。将E10到H106的数据复制粘贴到B1到E97。之后您就可以按照前面所述的步骤进行数据上传和在线免费分析了。