克隆长期做不出来，最大的原因是实验习惯不好！

我做不出来克隆的时间长达半年，期间克隆实验方面许多问题都遇到过，现在总结主要的一些问题和大家交流，希望大家以后不要犯我一样的错，少走弯路。

1、感受态细菌本身有质粒污染，这个问题困扰了我三个月，一直到最近才找到原因，我这里犯了最大的错是没有做过感受态检测。也许大家奇怪为什么在三个月内的时间里没有怀疑到感受态，不用奇怪，因为感受态“表现的太正常了”，每次涂板都长菌斑，每板20-30左右，很正常；我一个同学用这样的感受态做自己的克隆没有任何问题，得到了自己的克隆；我用这个感受态做T载体转化也没有问题，可以得到阳性克隆，因此很难让我想到是感受态的问题。

2、胶回收试剂盒，我用得是promega的，记住酶切产物一定要电泳之后回收，如果直接把酶切产物回收会造成大量的假阳性。这个问题困扰了我半个月。

3、我做的克隆是把大、小两个目的片段头尾相连到载体中，大小片段之间有一个共同的酶切位点，大小片段之间也有一段共同序列。由于引物设计错误，我人为地引入了一个插入突变，导致三个月的实验活白干。

4、在有经费的条件下，尽量避免改造质粒。我改造过质粒，想把质粒上的启动子删掉，中间过程很麻烦，最后也没有改造成功，因为改造后的质粒出现了一个莫名奇妙的变异——65bp的缺失突变，这个工作给我添了很多麻烦，细节就不说了。

5、测序长片段，比如4k左右或者以上请找一家好的测序公司，否则给克隆造成很大的影响，测序时间长不说，还有测错、测不出来等毛病。我总结的是宝生测序毛病最少，但该公司最大的问题是第一个测序反应的结果时间比较长，从送样开始到给结果需要一周。

建议大家以后注意下面的问题：

1、养成良好的实验习惯，开始接触克隆时都要做好对照，即做酶切时要做酶切对照，做转化是要做感受态对照和载体空载对照。

2、第一次做克隆时，要确定所有用到的材料都是好使的，其中最关键的是内切酶、buffer、载体、感受态大肠杆菌（常用DH5）和连接酶。如果这些都没有问题的话，就可以开始做了。

3、克隆材料没有问题的话，就要学习做克隆的相关方法，这里不再赘述了，有大量的经验心得之类的帖子可以在本网站找到。其中比较重要的是载体和连接片段的比例和大小。

4、很多有经验的人都说菌落PCR假阳性太高，这个问题我遇到过，当我把引物设计很好的时侯就避免了假阳性的出现，所以不要对菌落PCR存在偏见，关键在于引物的设计，我给T载体和pc DNA3.1都设计过筛选引物，都很好用。