第三代PCR技术--纪念Kary Mullis获得诺奖30周年

Mullis博士在发明PCR技术后曾这样描述：“用一个单分子DNA，PCR能在一个下午内产生100百万个相似的分子。反应很容易进行，只需要一个管子、一些简单的试剂和一个用来加热的设备”（Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat）

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30年来，PCR技术就如同阿基米德拿来撬动地球的杠杆一样撬动了生命科学研究的每一个领域。30年，PCR技术刚好发展到了第三代：

第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。定性PCR有几个缺点：1)采用毒性较大的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害，2)容易发生污染而造成假阳性结果，3)检测耗时长，操作繁琐，4)只能定性检测产物的有无，而不能对起始模板量进行定量。

第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），荧光定量PCR诞生于1992年，它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。荧光定量PCR需要借助校准物制备的标准曲线来定量，因此实际上是一种相对定量方法。而且不同厂家生成的仪器确定Cq值的方法不同，甚至同一个厂家还有多种确定Cq值的方法，实验者也可以根据自己的经验随意调节Cq值，这就直接造成了人与人之间、仪器与仪器间、实验室与实验室间的定量结果可比性差；荧光定量PCR也存在多个问题，如校准品和样品间背景不同而引入偏差、难以检测低拷贝数的靶DNA、样品与校准物的扩增效率不同、DNA提取中引人的杂质或DNA降解影响PCR的动态扩增等。

第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

Vogelstein和Kinzler第一次描述了数字PCR的概念，用于在大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞（如结肠直肠癌的致癌基因）。通过稀释样品DNA到每两个检测孔中才有一个分子，经PCR扩增后，向每个孔中加入特异性结合突变型的荧光探针和既能与突变型结合也能与野生型结合的荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。数字PCR要通过使用统计分析（如贝叶斯估计）来评估等位基因分布同正常值不同的可能性强度，因此将传统PCR的指数的模拟信号转换成线性的数字信号。

数字PCR的灵敏度取决于分析中采用的检测孔的数目和聚合酶的固有突变率。在聚合酶的保真性难以提高很大的情况下，增加分析孔的数量可有效提高检测的灵敏度。现代数字PCR的发展趋势是采用微滴式方法替代传统的稀释方法，通过对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分散成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理即可得出样品中靶分子的起始拷贝数。

数字PCR技术主要应用在以下几个方面：突变分析、评估组织内的等位基因失衡、体液DNA的癌症检测、混杂DNA的癌症检测、定量特异等位基因的基因表达等。

游引物F1和下游引物R1扩增的区域包含待检的突变位点。使用过量的引物R1，经不对称PCR扩增，产生可以同分子信标互补的单链DNA。绿色探针位于突变位点之外，因此既可以同野生型等位基因结合，也可同突变型等位基因结合。而红色探针只能识别和结合野生型等位基因。因此存在野生型DNA的孔能检测到红色荧光和绿色荧光两种荧光，而存在突变型DNA的孔检测到绿色荧光则相比红色荧光大大过量。

一对分子信标引物设计用来扩增一段约100bp的PCR产物，这段产物的中部包含一个单核苷酸多态性（SNP）位点。两个分子信标除了同SNP位点互补的碱基和标记的荧光分子外，完全相同。绿色和红色分别代表荧光素和hex标记。游离状态的分子信标的信号被3'-dabcyl基团猝灭而不发出荧光。当同互补序列杂交时，分子信标发出荧光。样品DNA被分配到384孔PCR板中，经PCR反应后，向每个孔中加入分子信标以确定等位基因状态。数字PCR和基于分子信标的等位基因鉴别也可整合到一步反应进行。

参考文献：

Pohl G, Shih le-M. (2004) Principle and applications of digital PCR. Expert Rev Mol Diagn 4(1):41-47

Vogelstein B, Kinzler K W. (1999) Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA 96:9236-9241

李亮, 隋志伟, 王晶, 臧超, 余笑波 (2012) 基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展. 生物化学与生物物理进展 39(10):1017-1023