PCR-SSCP(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)

【实验目的】 1．了解PCR-SSCP技术的原理。 2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。 【实验原理】 PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。 为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。 单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。 PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。 【实验用品】 1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。 2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖 3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。Tip头盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。 4．PCR扩增相关 试剂 。 【实验步骤】 1．PCR反应（同前） PCR产物经琼脂糖电泳确认。 2．PCR反应结束后，取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀，98℃变性10分钟，迅速冰浴。 3．非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.1 制备50ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加TEMED 25μl、10%过硫酸铵250μl，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入1´TBE电泳缓冲液，缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。 3.2 取已变性的5μl PCR扩增产物加到点样孔中，以200V/cm电泳4~5小时。 3.3 拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用 蒸馏 水冲洗1~2遍。 3.4 倒入固定液，固定8~10分钟。 3.5 用 蒸馏 水冲洗1~2遍；倒入银染液，银染10~12分钟。 3.6 用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。 3.7 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。 【实验结果分析】 观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上DNA单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。 【思考题】 1．PCR-SSCP检测突变的基本原理是什么？ 2．为什么进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之前，PCR扩增产物需与甲酰胺混匀并变性？