实时定量RT-PCR检测急性白血病患者中WT1表达

WT1（Wilms’ tumor gene,WT1）定位于11p13，是最早发现与Wilms’肿瘤发生、发展有关的基因。 WT1主要在胚胎发生过程中表达，对泌尿生殖系统的发育起重要作用，在成人，WT1仅在肾脏、卵巢、子宫内膜、睾丸、脾脏、乳腺及正常造血祖细胞微量表达 [1]。 研究发现几乎所有的白血病原始细胞（无论系别）都持续过表达WT1，与其在极少数生理性造血干细胞（CD34 + ）中短暂低表达形成鲜明对比，定性和半定量RT-PCR法在区别单个核细胞WT1是生理性还是病理性表达存在缺陷和限制，WT1作为“泛白血病标志”（panleukemic marker）在急性白血病中的表达及预后意义是一个有争论的问题[2]，为进一步准确检测，我们采用实时定量RT-PCR技术检测了108例急性白血病患者骨髓中WT1的表达水平，报道如下： 对象与方法 1 研究对象 所有的白血病患者均来自苏州大学附一院及附三院血液科2002年3月~2003年10月门诊或住院治疗的患者，男62例，女46例，年龄6岁~72岁之间，中位年龄36 .5岁。白血病的诊断均经临床、血象、骨髓象及组织化学染色、免疫分型、染色体检查确诊，部份患者行融合基因检测，符合白血病MIC分型。其中AML 95例（M0 2例，M 1 20例，M 2 38 例，M 3 18例， M 4 7例， M 5 10例 ），ALL 13例。对照组23例，为同期就诊非白血病患者（过敏性紫癜，缺铁性贫血 ，免疫性血小板减少性紫癜，巨幼细胞性贫血，淋巴瘤）及健康供者CD34细胞。以WT1高表达的K562细胞作为阳性对照。 2 主要 试剂 TRIzol总RNA提取液购自Gibco BRL公司，逆转录酶M-MLV购自Promega公司，Taq DNA聚合酶购自上海申友公司。 3 骨髓单个核细胞分离：常规抽取患者骨髓液2~5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（Ficoll分离液）分离单个核细胞，计数（5~10）×10 6 细胞加TRIzol总RNA提取液1ml，混匀后-20℃冻存（时间小于2月）用于RNA制备。 4 RNA提取及定量：采用TRIzol一步法提取骨髓单个核细胞总RNA，紫外分光光度仪测定OD 260 ，OD 280 吸光值（A），计算RNA含量。 5 cDNA链合成：逆转录反应体积为40ul，包括标本RNA 2ug，六随机引物100ng，5×逆转录buffer 5 ul, 10 mM dNTP 1.25 ul, Rnasin 25 U, 逆转录酶200 U。37℃ 45 min, 95℃ 5 min, -20℃保存备用。 6 定量阳性模板的克隆：培养K562细胞，在细胞生长的指数期收获细胞，同法提取RNA并逆转录成cDNA，Primer Premier软件设计引物（正义：5’-AGA GCG ATA ACC AC CAA CG- 3’；反义： 5’- GGC GTT TCT CAC TGG TCT CA -3’）扩增含WT1靶序的150bp的片段，纯化、测序后克隆至pMD18-T载体（上海申友公司），抽提、纯化重组质粒，测OD值，根据分子量及阿佛加德罗常数(6.023×10 23 分子数/mol)换算为分子拷贝数，按1011拷贝/ul浓度冻存于-20℃备用。GAPDH阳性模板由上海肿瘤研究所董强刚教授提供，以10 9 拷贝/ul浓度存于-20℃备用。