查尔酮合成酶基因的克隆

一、实验目的与意义 学习PCR操作技术，利用基因全长引物，扩增出查尔酮合成酶基因的全长，使学生掌握PCR的基本原理和操作。 二、实验原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。因此，PCR技术是生物和医学等领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成：①模板DNA的变性：模板DNA加热至93℃左右，双链变为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的链，重复变性--退火--延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 二、实验仪器

三、实验试剂  1．dNTP Mix (上海生工) 2．Taqase plus（北京鼎国） 3．模板DNA：20 ng/µL 4．引物（委托上海生工合成，经离心，用无菌ddH2O稀释成20 nmoI/L

5．10×Taqase plus缓冲液 6．无菌ddH2O