山东大学荧光定量PCR对比实验结果

为了证明Bioteke公司SYBR GREEN I实时荧光定量产品的质量，我们用国际知名品牌TaKaRa的SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)实时荧光定量进行对比，在相同的模板、引物和反应体系下，用Bio-Rad荧光定量PCR仪进行了对比实验。

实验材料

小鼠肝脏组织

山东大学实验室提供样品cDNA

实验方法

RNA提取：Bioteke RNApure高纯总RNA提取试剂盒a，操作步骤请参考说明书。

目的基因：小鼠管家基因β–actin，山东大学提供样品基因。

cDNA制备：测定小鼠肝脏总RNA浓度后，使用BioTeke Super RT Kit 制备20μl cDNA。操作步骤参照试剂盒说明书。

一步法荧光定量PCR：

Bioteke One-step SYBR real-time RT-PCR Kit 20μl反应体系包括：10μl 2×One-step SYBR premixture,7.2μl RNA Free Water, 0.4μl Primer F,0.4μl Primer R,1μl cDNA.1μl One-step RT。

二步法荧光定量PCR：

小鼠肝脏组织Bioteke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit. TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)。20μl反应体系包括：10μl 2×SYBR premixture,8.2μl RNA Free Water, 0.4μl Primer F,0.4μl Primer R,1μl cDNA. SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)，20μl反应体系包括：10μl 2×Master Mix, 8.2μl RNA Free Water, 0.4μl Primer F,0.4μl Primer R,1μl cDNA。

山东大学提供样品Bioteke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit. TaKaRa SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)。20μl反应体系包括：10μl 2×SYBR premixture , 4μl Primer F, 4μl Primer R,2μl cDNA. SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)，20μl反应体系包括：10μl 2×Master Mix, 4μl Primer F, 4μl Primer R,2μl cDNA。反应程序：95℃ 2min, 95℃ 10sec,60℃ 15sec,40个循环。

实验结果

用小鼠肝脏组织RNA直接进行一步法荧光定量PCR；RNA经反转录成cDNA后分别用BioTeke试剂和TaKaRa试剂同时进行两步法荧光定量PCR。

两公司试剂同时在小鼠肝脏组织通过两步法荧光定量PCR试剂扩增和山大实验室所提供cDNA及引物扩增结果。

扩增的小鼠肝脏样品熔解曲线较差，而山东 大学实验室所提供的cDNA和引物进行的扩增则完好。原因为由于长途携带引物和cDNA，保护措施不佳，造成引物和cDNA部分降解。

小鼠肝脏组织RNA经提取后直接用Bioteke One-step SYBR real-time RT-PCR Kit 进行荧光定量PCR后。

实验结论

经过不同样品的扩增后，可以看出BioTeKe公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit比TaKaRa公司的SYBR® Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)具有较高的扩增效率，在荧光值和灵敏度方面也有巨大的优势。另BioTeke公司的一步法Real-time PCR试剂盒也拥有非常好的扩增效果。