抑制消减杂交SSH步骤

一、cDNA第一链的合成

1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul（10uM） 随机引物（9mer），70℃温浴2min，然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：

2、42℃反应1.5hr，然后将离心管置于冰上，终止cDNA第一链的合成，然后马上进行第二链的合成。

二、cDNA第二链的合成

1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：

2、加入2ul（6U）T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。

3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。

4、加入100ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出cDNA双链，溶解于50ul双蒸水中。

三、cDNA质量检测

根据一个油菜线粒体基因Ccl1（GI：1694628）的cDNA序列设计特异性引物（CF：5′-TGA CAC GAG ATG ATA AAG A-3′ CR：5′-CGT AAC AAT AGA GCA GGA TAG-3′），目标片段大小为427bp。以反转录所得cDNA为模板，若PCR扩增能得到目标片段，说明线粒体mRNA已经成功反转录。

四、Rsa I酶切双链cDNA

1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：

2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。

3、加入50ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出酶切后的cDNA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。