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PCR技术

荧光标记法

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
原理荧光,又作“萤光”,是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比

原理

荧光,又作“萤光”,是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光(通常波长在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中,人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光,而不去仔细追究和区分其发光原理。利用荧光染料与被研究对象(蛋白、多肽等)吸附或共价结合后其荧光特性发生改变,从而反映有关研究对象性能的信息。

材料与仪器

人单核细胞系U937
胎牛血清 TRIzol试剂 Fluoro DD试剂盒 Supersript Ⅱ逆转录酶 Ampli Taq DNA聚合酶
手术刀片 PCR仪 凝胶成像仪 离心管 移液枪 水浴锅

步骤

一、材料
 
1.  标本

人单核细胞系U937,细胞密度2×108/L,分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2),N用1640培养基及10%胎牛血清培养,T1用IFN-γ104U/L LPS 1 μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0 μg/L分别刺激7 h。
 
二、 总RNA的制备
 
1.  按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA,以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性,并以紫外分光光度计检测其纯度。
 
三、 mRNA差异显示
 
1.   逆转录反应
 
选择锚定引物[T7(dT12)AP(anchored prime rs,AP)],序列为5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3',其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录反应,每管反应体系如下:总RNA l.0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25μmol/L,dNTPmix(1∶1∶1∶1),SuperScriptⅡ 60 Units,总反应体系20 μl ,42℃ 5 min,50℃ 50 min,70℃ 15 min。
 
2.   荧光标记差异显示PCR 
 
选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP],随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'),以逆转录产物为模板,进行PCR反应。反应体系包括:20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2,逆转录产物3.0 μl,50 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1),0.35 μmol/L 5'-随机引物,0.35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 Units,总反应体系10 μl。反应步骤如下:95℃ 2 min;94℃ 15 s,50℃ 30 s,72℃ 2 min,4个循环; 94℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,30个循环;72℃延伸7 min。
 
3.   分离差异显示片段
 
配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.25 mm,大小61×33 cm。将PCR产物加4.0 μl上样缓冲液,95℃变性后上样。3 000 V、100 W 、55℃电泳4.5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描,用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。
 
4.   回收差异条带
 
用AcquireSC软件将差异条带定位,用一次性手术刀片切割下所需条带,置于30 μl去离子水中,37℃水浴30-60 min,备用。
 
5.   差异条带的再扩增
 
以经上述处理的回收条带为模板,T7启动子22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’)、反M13(-48)24-mer(5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物,进行再扩增反应:模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNTP mix(1∶1∶1∶1),0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits,总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PCR。

常见问题

一、实验讨论

基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异,是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术,为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点,一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而,该技术也存在着一些缺陷,主要表现为:cDNA产物的质量较低,在序列胶中往往呈不清晰状态;所得的cDNA片段通常小于500 nt,往往是3'-端的非翻译(编码)序列;所得差异片段的假阳性高,可高达85%等。
 
荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进,极大减少了上述不足。
 
差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型,本实验通过使用双碱基锚定引物,将总mRNA群体分为12个亚群,这极大减小了每一锚定引物 产生的第一条cDNA链的数量,不仅可降低随机引物的用量,更可降低DD产物的复杂性,使差示条带在序列胶上易于分辨,从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等,且3'-端以G或C结尾,可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等,差异片段的长度可达1.0-1.5 kb, 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot 进行分析鉴定辨别真假阳性克隆,且其中可提供更多的序列信息,故获取大的片段具有重要的意义。
 
文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。通常, 再扩增的引物与DD引物相同,本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer),此为在锚定引物的5' 端和随机引物的3' 端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分),这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时,T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针,为cDNA片段的直接测序和鉴定(RPA或Northern分析)提供了方便。
 
用常规的序列分析胶进行分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用5.6%的PAGE胶(聚丙烯酰胺),减少胶的厚度(仅250μm),通过提高电泳的电压(3000 V)及温度(55℃),可显着提高分辨率。
 
同位素标记存在曝光时间长、带型不佳,基本与相邻的带混合、污染等缺点,将荧光物 质标记于锚定引物的5’端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果,操作周期仅两天。


目前,DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理 、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。


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