RNA 提取策略及RT－PCR技术

第一部分RNA 提取策略

1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。

外源性RNA酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，塑料手套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的地方提取RNA。我上面说了内源性RNAase污染才是关键，所以有些同志没有注意这些对外源性RNAase的防护RNA也提取的很出色。但是如果你运气不太好的话外源性RNAase污染影响很大的。

2、样品的取材 我们抽提RNA往往都是需要其mRNA，而mRNA的表达量和细胞或者组织的生长状态息息相关，我们取组织块应该避免取到坏死组织，而细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍为快些，甚至可以不消化下来直接进入裂解步骤；此外还可以采取先震荡敲击培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合下降，然后用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下来，这样细胞的代谢不会明显的受到抑制。

注意在平时传代的时候就要注意观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提ＲＮＡ）。

3、待提取样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是要对这些保存方法的优缺点有清醒的认识。根据你需要的RNA种类可以做简单的分类。包括RNA病毒RNA ，mRNA（各种），rRNA等其中最容易降解或者破坏的就是mRNA，最不容易损失的就是RNA病毒RNA（因为有蛋白壳保护）。

超低温保存： 特指液氮保存不管组织还是细胞如果需要其中的mRNA必须在液氮中保存，-70度等方法都是错误的方法，在很短的时间内或许可以，但是长期是不可能的。-20~~~-70摄氏度保存： RNA病毒的RNA可以在这个温度段安全的保存。但是其产生的mRNA还是必须超低温保存。

4度保存： 有特殊的保护试剂存在地情况下组织的保存：应该是离体后在1min内就放入液氮或者保护试剂中。由于提取RNA对组织块有一定量的要求，大约100mg居多（脂肪细胞需要的量多的多，因为细胞是大大膨胀的），所以在取材前就需要明确到底你需要的组织大概多大是100mg，令少勿多。

如果是取临床的标本，就应该带上液氮罐子，DEPC处理的器械，锡箔纸，线等在手术室外等候，标本一切下就尽快进行切割（大概100mg一块），包装（锡箔纸内），捆扎（方便在液氮罐子中寻找），迅速丢入液氮罐子中，最好是1min内完成（所以大家取材前一定要好好联系一下，不要到时候手忙脚乱的^_^）细胞的保存：比较麻烦些，所以大多都是直接提取RNA再保存。建议离心收集后用特殊保护试剂重悬后保存。

4、RNA提取提取RNA可以分为总RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA；

Trizol最早是MRC实验室的科学家发明的方法，后来把专利卖给了invitrogen/Gibco，invitrogen/Gibco将此方法推广到世界。他的trizol曾经由其他公司OEM制作，现在已经自己生产。

本来Trizol是一个专利的品牌，但是国内也有不少仿制的品牌，基本的原理是一样，配方稍有不同。RNeasy kit： Qiagen的王牌产品，号称适用于各种RNA抽提，其实在特殊的组织比如大脑，肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽提试剂为佳。此外细菌RNA抽提也最好使用专用抽提试剂盒。这些产品Qiagen都提供。注意凡是Qiagen的试剂盒抽提应该是没有5S带的，因为它将5S破坏掉了。其他的比如roche，promega等都很好的是的。尤其promega性价比最高！

注意各种方法对于组织都需要先碾磨，应该用陶瓷碾磨器，同时一定要在碾磨同时不断的加入液氮。（少数牛人号称从来不加液氮也提取的很好，我只能说他运气实在不错）。

特殊的RNA抽提试剂盒---mRNA抽提试剂盒： 单纯的抽提mRNA的试剂盒很少见到有人在使用，但是其具有一般RNA抽提试剂盒没有的优点，在一些实验中有出奇致胜的效果，推荐promega的总RNA提取KIT，效果与Qiagen差不多，价格便宜多了，性价比最高的好东东！

试剂盒提取的其优点有以下几点：

1、提取得mRNA纯度高，因为对于很多实验rRNA其实也是一种污染，我们只想RT我们需要的mRNA，但是如果用特异性引物或者随机引物就会连rRNA 一起RT，造成大量的我们不需要的cDNA出现。

2、鉴定时观察是否有严重的DNA污染时非常方便。mRNA抽提后电泳只是看到淡淡的一条短拖影带，此时如果有DNA污染可以很容易发现，因为背景很浅。

3、RNA的鉴定RNA抽提出来之后，首先做的工作是分装保存，然后取其中一管用于鉴定。鉴定方法如下： 对RNA的鉴定包括几个方面，第一是数量的鉴定，第二是质量的鉴定，重点是质量的鉴定。

一般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲醛变性电泳（又不是做northern，实在没有必要）。电泳槽注意一定不要用DEPC处理，一定要保证电泳体系中有少量的RNAase存在。分别在加样孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁边加入DNA marker。1%琼脂糖凝胶，10V/cm的电压，电泳10min成像一次，看电泳情况，如果28s和18s还没拉开，继续电泳10min成像，如果任没有拉开再次电泳5min。如果还没有分开多半28s已经遭到破坏，不可能看到典型的3条带了。

好的RNA的特征：

A、RNA应该呈现出3条rRNA带。分别是5，18，28SrRNA的带。5s最好是要可见，除非抽提步骤中故意将其破坏

B、28s亮度是18s亮度的一倍，其他比例关系均提示RNA有一定程度的破坏。