提高RT-PCR的灵敏度与产物长度
材料和方法
1. Eppendorf cMaster RTplusPCR系统
2. Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic试剂盒
3. 所有的PCR反应均在Eppendorf Mastercycler-gradient梯度PCR仪上进行。
实验1：一步法灵敏度检测RT－PCR
扩增目标：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA：从人HELA细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度从1μg递减至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系统，标准一步法RT－PCR方案。1:10 稀释RTplusPCR 缓冲液，镁离子终浓度2.5 mM，反应总体积50μl
循环参数：
| 循环 | 步骤 | 温度 | 时间 | 描述 |
|---|---|---|---|---|
| 1x 1 | 1 | 50°C | 30分钟 | 逆转录 |
| 1x 2 | 2 | 94°C | 3分钟 | 初始变性 |
| 40x { | 3 | 94°C | 15秒 | 模版变性 |
| 4 | 68°C | 45秒 | 引物退火/延伸 |
cMaster RTplusPCR 系统显示出一种依赖于模板RNA 量的宽广的产物产量动力学范围。能从低至10 pg 的HELA 总RNA中检测到α微管蛋白mRNA。
实验2：一步法扩增长片段RT－PCR
扩增目标：5.3 kb 的人结节性脑硬化因子（hTSF）mRNA 片段。
模板RNA：从人HELA 细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度为100 ng 和10 ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，针对长模板的特殊RT－PCR 方案。
设置一步法RT－PCR 反应。
| 成分 | 50μl RT－PCR反应体积 | 反应成分的终浓度 |
|---|---|---|
| 不含RNA 酶的水 | 2.5μl | |
| dNTP 混合物每种dNTP 浓度均为10 mM | 2.5μl | 500μM |
| hTSF正向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| hTSF反向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| 总HELA RNA | 3.0μl | 每个反应中中含10ng－100ng |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 34.0μl | |
| 含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液 | 5.0μl | 1×；2.5 mM 镁离子 |
| cMaster RT 酶 | 0.5μl | 0.15U /μl |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.5μl | 0.05U /μl |
| MasterMix 2 | 40.0μl |
循环程序参数
| 循环 | 步骤 | 温度 | 时间 | 描述 |
|---|---|---|---|---|
| 1x | 1 | 65°C | 5分钟 | 初始RNA变性 |
| 1x | 2 | 42°C | 60分钟 | 逆转录 |
| 1x | 3 | 93°C | 3分钟 | 初始变性 |
| 35x { | 4 | 94°C | 15秒 | 模版变性 |
| 5 | 59°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 6 | 68°C | 5.5分钟 | 引物退火 |
应用一步法RT－PCR 方法，可以从100 ng 和10 ng 总RNA 中检测到5.3 kb 的hTSF PCR 产物。这个PCR 反应非常困难，大多数RT－PCR 试剂盒生产厂家从未发布过应用一步法方案，有效扩增类似长度模板的结果。相反，Eppendorf 试剂盒能稳定可靠地从10 ng HELA 细胞RNA 中扩增该产物。
实验3：两步法RT－PCR
两步法RT－PCR 的扩增目标：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA 片段
1.3kb 的（鼠和人）肿瘤坏死因子受体（TNFR1）mRNA 片段
5.3 kb 的人结节性脑硬化因子（hTSF）mRNA 片段
12.3 kb 的鼠动力蛋白mRNA 片段
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，采用产品说明书中的针对普通长度模板和较长模板的两步法RT－PCR 程序。所有的逆转录反应均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物为引物。
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