差异显示PCR的技术路线

一、总RNA的提取

总RNA的提取方法多种多样，目前常用的酸性异硫胍一步法、Trizol法和使用标准RNA分离试剂盒。抽提的关键是尽量减少RNA酶的污染，为减少假阳性，相比较的样品在同一条件下应用同种方法同时抽提，抽提的总RNA在反转录前必需经过脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）充分消化，可设立不加反转录酶的对照来检验DNA是否被去除。

紫外分光光度仪测其纯度，甲醛变性凝胶电泳测其完整性，28sRNA、18sRNA正常含量比值为1.5-2.2：1，若比值小于1：1，说明总RNA明显降解，不能满足实验要求，RNA是否降解及降解的程度如何，是实验成功的关键。

二、引物设计的优化

最初认为需要12种锚定引物，即T12MN和至少20种不同的随机引物才能把细胞中的mRNA全部显示出来，但通过实验发现，起决定作用的是3’端最后一个碱基，而3’端的倒数第二个碱基可呈现兼并性。因此，第2代差异显示采用四种T12MN引物。

第三代差异显示技术是利用单碱基把引物锚定于poly（A）的起始端，同时在锚定引物和随机引物的5’端引入限制酶切位点，以便克隆差异表达的片段，而引物的延长使cDNA谱带的选择性及重现性都增强。

三、标记方法的选择

以前多采用放射性同位素（35S或32P）检测法来进行差异条带的显示，这种方法虽敏感性强，但存在很多缺点，如费时费力、对人身体有害等，最重要的是，为从DNA测序胶上比较密集的条带中分离出差异条带来，实验者必需手拿X光胶片作为对照来切割凝胶上肉眼看不到的条带，盲目性很大。

近几年来多采用非放射性同位素标记的方法，目前常用的有：

⑴荧光标记法：该方法是基于荧光素用测序的原理，对DD-PCR略加改进而建立的一种快速、安全、可靠、敏感并且能同时检测大量样本的mRNA差异显示技方法。

与同位素相比，实验时间缩短，且减少了污染，同时该方法加长了引物，可减少电泳条带的复杂性，有利于回收差异条带特异扩增。有人用荧光素标记随机引物来进行mRNA差异显示取得了较好的结果。

但荧光法也有缺点，如出带较少，仪器设备昂贵，难以推广，且不同实验室的引物缺乏统一性。

⑵银染法：其灵敏度比EB染色高200倍，硝酸银等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链、双链DNA和RNA都染成黑色。

具有简便、快速、高效等优点，最重要的是能直接在凝胶上观察比较差异条带，用肉眼可见的方法从凝胶上切下差异的条带，避免同位素曝光切带的盲目性，并可避免同位素的危害。陈瑞川等用此方法来做的胃癌标本的差异显示，陈晓梨等用此方法来做白血病的差异显示，都取得了较好的结果。

⑶化学发光检测法：基于化学发光测序法已被广泛应用，已证明是一个与同位素一样敏感、可靠的测序方法。Rajeevan等在该方法的应用上获得了一定的经验。不过该方法不像银染法那样可以直接从凝胶上切除肉眼可观察到的条带，仍需用显影的膜作对照从凝胶上切取感兴趣的条带，所以还有一定的差异性，且转膜、发光检测等也较复杂。

⑷地高辛标记法：和前几种方法基本类似，与发光法相比，最突出的优点是直接在尼龙膜上显示和再扩增差异条带。南清振等[12]成功的用此方法分离并克隆出大肠癌相关基因。综合比较上述几种方法的优缺点，银染法是目前最可取的一种标记方法。

整个过程在2个工作日内便可以完成，不受预定同位素，自显影曝光时间的限制，且费用比其他方法都要低，无污染，不需特殊设备，操作简单灵敏度也相当高，宜推广。

四、PCR扩增条件的改进

PCR扩增时的退火温度是决定PCR扩增特异性的关键因素之一。目前，随着引物设计的改进，Liang等将反应条件做了如下改进：由原来的94℃变性30秒，40℃退火2分钟，72℃延长30秒，进行40次循环改进为先进行1次低严格性循环。

即94℃变性1分钟，低严格性退火40℃ 2分钟，72℃延长1分钟，紧接着进行高严格性的PCR反应：94℃变性45秒，60℃退火2分钟，72℃延长2分钟，进行35次循环。这提高了差异显示的重现性，降低了其假阳性率。

五、差异条带的回收和再扩增

为避免多种组份的差异带内含有假阳性cDNA，Kang等在DDRT-PCR呈现差异条带之后，克隆差异条带之前，对PCR扩增产物进行消减杂交，以去除假阳性cDNA片段，即回收目的方差异条带的同时，回收对照方相应范围内的条带，回收的差异带用非生物素标记引物与dATPs进行PCR扩增。

对照方回收的产物用生物素标记的dATPs进行PCR扩增，将两者的PCR产物进行削减杂交，用链酶亲和素-生物素磁珠分离系统去除杂交产物，剩下的产物则再次扩增，可重复差异显示，增加差异带的特异性；

Viula-Oritix等则用单连构型多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）并结合印迹杂交，估计和筛选差异条带中的多种组份，以去除假阳性片段，进行有效克隆，获得成功。

回收条带的再扩增与DD-PCR扩增的参数基本一致，但随着引物设计的延长，再次扩增时应放弃DD-PCR不太严格的做法，若严谨设计PCR反应参数，可极大减少非特异性扩增，降低假阳性率，同时也能保证高效产率。

六、差异条带的鉴定

从测序胶中分离的差异条带一般经过Northern印迹来确定其真实性。Northern印迹迄今为止仍然是鉴定的一个主要手段，它要求mRNA样品量较大，对于微量组织和细胞则不适合用此方法鉴定。鉴于此，有些学者采用原位杂交和用差异序列特异性引物的RT-PCR法来鉴定。

缺点在于，样品如有DNA污染，或PCR过程中碱基错配，都可导致假阳性，不如Northern印迹结果可靠。如果条件允许，可进行进一步研究，在蛋白水平上来鉴定，免疫组化、细胞化学和免疫杂交法也可被应用。鉴定后将差异条带再进行cDNA克隆、测序，最后将测序结果进行GeneBank同源性检索。