RFLP实验操作步骤

一、材料

基因组DNA（大于50 kb，分别来自不同的材料）。

二、设备

电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比胶块略大）4块，吸水纸若干，尼龙膜（依胶大小而定），滤纸，eppendorf管（0.5 ml）若干。

三、试剂：

1. 限制性内切酶（BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及10×酶切缓冲液。

2. 5×TBE电泳缓冲液。

3. 变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl。

4. 中和液：1 mol/L Tris·Cl，pH7.5/1.5 mol/L NaCl。

5. 10×SSC。

6. 其它试剂：0.4 mol/L NaOH，0.2 mol/L Tris·Cl，pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25 mol/L HCl。

四、操作步骤 1. 基因组DNA的酶解

（1）大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验，要求提取的DNA分子量大于50 kb，没有降解。

（2）在50 μl 反应体系中，进行酶切反应：

5 μg 基因组DNA 5 μl 10×酶切缓冲液 20单位（U）限制酶（任意一种） 加ddH2O，至50 μl

（3）轻微振荡，离心，37℃反应过夜。

（4）取5 μl 反应液，0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30 kb 的明显亮带出现。 2. Southern转移

（1）酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳（可18 V 过夜）后EB染色观察。

（2）将凝胶块浸没于0.25 mol/L HCl中脱嘌呤，10分钟。

（3）取出胶块，蒸馏水漂洗，转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。

（4）预先将尼龙膜，滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸（桥）然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆二层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。

（5）取下尼龙膜，0.4 mol/L NaOH30秒，迅速转至0.2mol/LTris·Cl，pH7.5/2×SSC，溶液中，5分钟。

（6）将膜夹于2层滤纸内，80℃真空干燥2小时。

（7）探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。