PCR反应体系的寡聚核苷酸引物

一、引物设计的原则 1. 一般原则 （1）引物长度应在15~30 bp。其Tm=（G+C）×4+（A+T）×2，引物的有效长度Ln=2（G+C）+（A+T）；Ln<38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃，不能保证引物的特异性。 （2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免一连串相同的碱基。3‘端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 （3）G+C含量在40%~60%。 （4）两个引物在3’端绝对不能出现同源性，否则会形成二聚体。两引物之间不应有互补性，引物间连续的互补碱基必须少于4个。

2. 引物的3‘端引物的延伸是从3’端开始的，因此，引物3‘端的末位碱基在很大程度上影响TaqDNA聚合酶的延伸效率，不能进行任何修饰。

实验表明，不同碱基的引发效率在引物3’端末位碱基处有错配时，有很大的不同。同等条件下，引物3‘端第2位或3、4位的错配对扩增量影响不大，但易出现非特异扩增和引物二聚体。所以在设计引物时，应注意引物3’端尽量不用T，尤其应避免连续2个或2个以上的T。

3. 引物的5‘端引物的5’端对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。如增加酶切位点、引入突变位点、标记生物素等。 4. 密码子的简并，如扩增3‘端区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，影响扩增特异性与效率。 二、引物的浓度 为使PCR效率达到最高，必须保证反应混合物中有足够的引物和dNTP。一般PCR反应中，引物的终浓度为0.2~1 μmol/L。在此范围内，PCR产物的量基本相同；但引物低于0.2 μmol/ L时，产物量降低。 引物浓度过高则会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。