PCR污染及解决对策

 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，在微生物感染的诊断中具有重要的价值。在PCR扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的，经过n个循环的扩增，一个DNA分子的产量便达到2n个拷贝。PCR产物一般为1013拷贝/ml，取0.1ml即为109拷贝，而1mg人基因组DNA才含1.4´106拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。此外，利用PCR反应，还能够对感染因子实施定量分析，实时监测其在宿主体内的动态变化，有利于指导临床诊疗。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染便可导致假阳性结果。PCR反应中，主要存在三个污染源：1.标本间的交叉污染；2.实验室克隆质粒的污染；3.PCR扩增产物的污染。其中以第三个污染源最主要，通过下面一个例子便可认识到PCR产物污染的严重性。在100ml的反应管中可产生1012拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池（50m´25 m ´2m）内稀释后，0.1 ml稀释液含有400拷贝的扩增分子，远远超过了PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。本文就PCR污染的预防、污染源的追踪及污染的处理进行分析。 一． 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区   目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂  PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA： 1． PCR用水应为高压的双蒸水； 2． 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； 3． 引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三) 实验操作注意事项  尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 二． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。         环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三．污染处理 （一）环境污染 1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。 （二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR； 3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法； 4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。 （三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法    由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。 1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。 3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5�端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3�端或近�端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。 （四） 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。 （五）RS-PCR法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3�端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5�端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。 （六）抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。 四．其它PCR检测方法： （一） 两步法：是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时，两对引物在同一个管中以简化步骤，减少污染。通常第一步进行20-25个循环，扩增外引物片段；第二步再进行10个循环，扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求，即内外引物的退火温度高（如68℃），在此温度下内引物不与模板退火，然后降低退火温度（至55℃）再扩增内引物片段，这样，在操作过程中，仅打开PCR反应管一次，大大减少了污染的可能性。 （二） 荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresence  PCR, F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功的，它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外，还可用HEX、JOE作为报告荧光，3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在探针被切断后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。 主要有以下优点： 1.探针特异性强，假阳性率低； 2.操作快速，不需要PCR后处理； 3.定量范围宽，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)； 4.闭管操作，PCR产物污染少； 5.灵敏度高。 主要方法有： 1..荧光探针法：进行荧光PCR检测时，要求荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以20-30个碱基为宜，必要时3′端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断，故可进行定性与定量检测。        荧光探针5′端标记的TAMRA，在480nm激发下产生530nm的红色荧光；3′端标记的FAM，激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统，即采用双荧光探针，如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器，可进行实时（real-time）定量检测。    2．分子信标法：分子信标（molecular beacon）是一个发夹样结构的特异探针，其环状部分与靶序列互补。在室温时，分子信标的发夹紧闭，荧光淬灭。PCR扩增时，随着温度升高，发夹松开，与单链模板特异结合，发出荧光。荧光强度与模板呈正比，故可用于PCR产物的定性及定量。