Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > PCR技术

PCR技术

PCR产物的TA克隆

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
原理PCR产物克隆大致分为两类,即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平

原理

PCR产物克隆大致分为两类,即平头连接和粘头连接。


平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR 产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。如果要求不高,PCR 产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,这两种酶有5’→3’校对能力,扩增出来的PCR 产物已经是平头,可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。


粘头连接也可以大致分为两类,一类粘头连接是用某种方法,在载体和PCR 产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列,就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR 产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性,构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头,在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时(也有人报道处理1~2小时能提高克隆 效率,这样加T反应会更彻底)。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR 产物串连可以忽略。如果使用ddTTP,效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆 ,比平头连接效率高50~100倍。

材料与仪器

PCR产物
T4 DNA连接酶 ddH2O 
离心机 水浴锅

步骤

1、连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。


2、10μl体积反应体系如下:


(1)取T载体1μl (50ng),加入等摩尔数PCR 产物 。


(2)加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA连接酶合适单位,用ddH2O补足至10μl 。


(3)稍加离心,通常为14-16℃水浴连接8-14hr,或4℃过夜。


(4)转染,蓝白斑筛选同前。

注意事项

1.要获得目的基因的TA克隆 ,PCR 产物的特异性要好。


2.PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。


3.在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。


常见问题

平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。
文章底部广告位

文章评论

加载中~