一种优化的PCR 方法——降落PCR 扩增目的基因

多聚酶链式反应( PCR) 是在模板DNA、引物和4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA 聚合酶的酶促反应[1 ] 。在实验室日常工作中经常出现两种情况:一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物,另一种情况是未扩增出任何产物。影响PCR 的因素很多,除了受 PCR 仪器性能的制约外,也取决于反应体系和反应条件的设置,其中Mg2+ 浓度、缓冲液pH 值、循环条件等因素尤为重要,而循环条件中的退火温度又是至关重要的因素。降落PCR 是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低[2 ] ,从而达到最佳扩增条件的方法。我们在构建人 CD137 - hIgG1Fc - pCDNA3 融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV DNA 多聚酶基因突变的过程中运用降落PCR 进行了扩增目的基因的尝试。

1 　材料和方法

1.1 　质粒含有人CD137 全长cDNA 序列的pCDNA3 质粒(CD137 - pCDNA3) ,由Herbert Schwarz 教授惠赠; 含hIgG1 FccDNA的PGEM - T质粒由第二军医大学曹雪涛教授惠赠; HBV DNA ,从6 位慢性HBV 感染者血清中抽提获得。试剂:PCR 试剂盒购自上海生工生物工程公司。引物:扩增人CD137 胞膜外区的引物P1 :5’CCC AAG CTT ATG GGA AAC AGC TGT TAC 3’, P2 :5’AAA CTG CAG CTG CGG AGA GTG TCC TG 3’;扩增hIgG1Fc 的引物P3 : 5’AAA CTG CAG TCT TGT GAC AAA ACT CAC 3’, P4 : 5’CCC GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG 3’,扩增 HBV DNA 多聚酶的第一轮引物P5 :5’TTC CCC CAC TGT CTG GCT TTC AGT CAT 3’, P6 :5’ ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA 3’,第二轮引物P7 :5’TTC CCC CAC TGT CTG GCT TTC AGT CAT3’, P8 : 5’ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA3’由上海生工生物工程公司合成。

1.2 　降落PCR 扩增目的基因

反应体积为50μl ,人CD137 胞膜外区基因的 PCR 扩增体系: CD137 - pCDNA3 质粒4μl , P1 , P2 各015μmol/ L , MgCl2 2mmol/ L , dNTP014mmol/ L , Taq 5U ; hIgG1Fc 片段的PCR 扩增体系:含人hIgG1Fc 的PGEM - T 质粒4μl , P3 、P4 各014μmol/ L , MgCl2 2mmol/ L , dNTP014mmol/ L ,Taq 5U ; HBV DNA 多聚酶基因的PCR 扩增体系, 第一轮: HBV DNA 模板 4μl , P5 、P6 各0125μmol/ L ,MgCl2 115mmol/ L , dNTP012mmol/ L , Taq 018U ,第二轮: 取5 倍稀释的第一轮PCR 产物4μl 为模板, P7 、P8 各 0125μmol/ L ,MgCl2 115mmol/ L ,dNTP012mmol/ L ,Taq 018U 。分别在各灭菌PCR 管加入上述各反应成分,100 ℃煮沸5min ,立即冰浴5min , 加入 Taq DNA 聚合酶,混匀,离心,PCR 程序如下: