反转录差异显示技术(DDRT-PCR)及其方法的改进

摘　要：运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况，为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理,优点与缺点,以及近年来对该技术涉及的RT-PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价，并对其应用前景进行了简单分析。

关键词：反转录差异显示PCR；反向northern印迹；银染

基因的差异性表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因，而且也是各种生理及病变过程的物质基础，因此，分离、鉴定差异表达的基因具有重要的意义。真核生物基因组中，仅约10％～15％的基因在细胞中表达，而且不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。

1992年美国哈佛医学院的两名科学家Liang P和Pardee A D 根据高等生物成熟的mRNA都带有poly(A)的特性，用特定的锚定引物反转录后，进行PCR扩增，率先建立了mRNA差异显示技术[1]。1994年Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT-PCR）。与研究DNA差异相比，研究mRNA的差异排除了非编码区的影响，使研究范围缩小到表达基因水平上，为人类进一步了解生命过程打开了大门。

1 、 DDRT-PCR技术的基本原理

真核生物基因的mRNA 3′端多数都带有一段多聚腺苷酸结构，有12种组合：5′-NMAAA…AA-3′其中N代表A、G、C、T任意一种碱基，M代表G、C、T任意一种碱基。根据此种序列特征，按碱基配对的原则，人工合成Poly(dT)引物时在其3′末端加上两个锚定碱基引物：5′-TTT…TTTMN-3′（M，N同上）。此引物可将mRNA反转录成cDNA（又称为第1链），用此引物锚定cDNA第2条链3′端，用5′端随机引物与cDNA第1条链互补进行PCR，随机扩增cDNA片段。

将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，即可显示不同的条带位置，比较不同组间的显示结果，挑选差异条带，经回收再扩增，通过杂交验证、克隆测序等，进一步分析其结构与功能。杨谊等认为DDRT-PCR技术可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变，差异表达基因的迅速测序并与基因库比较，单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从cDNA文库或基因组文库中分离基因。

2 、 DDRT-PCR技术的优点

当前，寻找差异表达基因的方法除了DDRT-PCR之外，还有减杂交（subhybridization,SH）、抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridiza-tion, SSH）、RNA随机引物PCR（RNA-arbitrarily primed PCR, RAP-PCR）、代表性差异分析（representational difference analysis, RDA）、DNA微阵列（DNA Microarray，或DNA芯片）和基因表达系列分析（serial analysis of gene expression, SAGE）等。据美国Medline 1999年12月的调查，用以上方法来克隆差异表达基因的文章共计1810篇，其中有67％是采用DDRT-PCR技术[2]，由此可见其实用性和广泛性。

DDRT-PCR的优点可概括为3SRV(simplicity,sensitivity,speed,reproducibility,versatility)[3]：

①简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳；

②可以同时分析多组样品；

③灵敏性高，仅需0.2μg总RNA作为起始材料，可检出低丰度mRNA；

④实验周期短，约8d即可完成，便于重复；

⑤最突出的优点是实验过程中可步步验证比较；

⑥可进行多基因家族的表达分析。