聚合酶链式反应（PCR）—当前应用最广泛的先进分子生物学技术

分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。

1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。

这一技术在很短的时间里即风行全球，不同学科的科学家都蜂拥而上，在近年形成了分子生物学领域的热潮，期望凭借这一工具来提高研究水平，解决所面临的一些难题。

早在四十年以前人们对遗传基因的化学本质并不清楚，后来发现脱氧核糖核酸（DNA）是遗传信息的主要载体。DNA的基础构成单位是核苷，核苷的排列顺序规定遗传密码并形成了基因。DNA是双螺旋结构，以半保留的方式进行复制的（Warson, 1953），1958年Meselson证实了DNA半保留复制模型。

60年代对基因表达和调控研究又取得很大进展，从细胞中分离目的基因并在体外克隆和表达受到人们的普遍关注。由于对DNA连接酶及限制性内切酶的合理使用，DNA重组到质粒或噬菌体载体中，在细菌中表达成为70年代基因克隆的最常用技术。

Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想，由于当时不能合成寡核苷酸及DNA测序等困难而受阻。

直到1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary. B. Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。Saiki首次描述利用PCR方法扩增人珠蛋白DNA，并用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。

Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，所用大肠杆菌DNA聚合酶 I的KLENOW片段催化复性引物的延伸，由于该酶不能耐受使DNA变性的高温，所以每一轮反应都需添加新的酶，产量不高且操作繁复，对实验操作要求较高，无法推广使用。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。由于Taq酶能够耐受97.5℃加热5-10分钟，因此使DNA变性的94℃加热不使其失活，整个反应只加一次酶即可，并且高温反应也增加了扩增的特异性和效率，易于自动化进行。Mullis因其杰出的贡献，1993年获诺贝尔化学奖。

PCR技术能快速特异地在体外复制目的，理论上能将其量极微的（fg DNA）目的基因在较短的时间内（1-2小时）扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。

然而其基本原理并不复杂，主要包括模板DNA（目标DNA）加热变性；降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性；72℃条件下，Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应，模板拷贝数都增加一倍，理论上n次循环后，扩增产物拷贝数为2n－1。

但在PCR反应后期由于底物的消耗，Taq酶活力的下降，PCR抑制物的增加，PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上30-35个循环，扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高扩增产物的量，可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的PCR扩增，一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。

一、变性，DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。解除条件后，变形的单链DNA可以重新结合起来，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度（Tm）。

不同DNA的解链温度不同，取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键，A-T间有两个氢键，因此G-C比例大的DNA片段解链温度高，一般，G-C含量每增加1％，PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间，PCR变性温度选择94℃，变性时间为30秒到2分钟。